1. Fehim inizjali

F'dan l-istadju, irridu nifhmu xi kunċetti u terminoloġija, sabiex nevitaw li nagħmlu żbalji quddiem l-anzjani tagħna, bħal:

Q: X'inhi d-differenza bejn RT-PCR, qPCR, PCR f'ħin reali u RT-PCR f'ħin reali?

Tweġiba: RT-PCR huwa PCR ta' traskrizzjoni inversa(PCR traskrizzjoni inversa, RT-PCR), li hija varjant użat ħafna tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR).Fl-RT-PCR, linja RNA hija traskritta b'lura f'DNA komplementari, li mbagħad tintuża bħala mudell għall-amplifikazzjoni tad-DNA permezz tal-PCR.
Real-time-PCR u qPCR(Kantitattiv Rea-ltime-PCR) huma l-istess ħaġa, it-tnejn huma PCR kwantitattivi f'ħin reali, li jfisser li kull ċiklu ta 'PCR għandu rekords tad-dejta f'ħin reali, għalhekk in-numru ta' mudelli tal-bidu jista 'jiġi aġġustat analiżi preċiża.

Għalkemm kemm PCR f'ħin reali (PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali) kif ukoll PCR traskrizzjoni inversa (PCR traskrizzjoni inversa) jidhru li huma mqassra bħala RT-PCR, il-konvenzjoni internazzjonali hija: RT-PCR tirreferi speċifikament għal traskrizzjoni inversa.PCR , PCR f'ħin reali huwa ġeneralment imqassar bħala qPCR (PCR kwantitattiv f'ħin reali).

U RT-PCR f'ħin reali (RT-qPCR), Hija t-traskrizzjoni inversa PCR flimkien mat-teknoloġija kwantitattiva fluworexxenti: l-ewwel akkwista cDNA (RT) mit-traskrizzjoni inversa tal-RNA, u mbagħad uża PCR f'ħin reali għal analiżi kwantitattiva (qPCR).Il-biċċa l-kbira tal-laboratorji jagħmlu RT-qPCR, jiġifieri riċerka dwar ir-regolazzjoni 'l isfel tal-espressjoni tal-RNA, għalhekk il-qPCR li kulħadd jitkellem dwaru fil-laboratorju fil-fatt jirreferi għal RT-qPCR, iżda ma ninsewx li għad hemm ħafna testijiet tad-DNA f'applikazzjonijiet kliniċi.Analiżi kwantitattiva, bħall-iskoperta tal-HBV tal-virus tal-epatite B.

Mistoqsija: Wara li taqra ħafna PCR kwantitattiv fluworexxenti, għaliex il-framment amplifikat għandu jiġi kkontrollat ​​fil-medda ta '80-300bp?

Tweġiba: It-tul ta 'kull sekwenza tal-ġeni huwa differenti, xi wħud huma diversi kb, xi wħud huma mijiet ta' bp, iżda għandna bżonn biss li nirrikjedu li t-tul tal-prodott ikun 80-300bp meta niddisinjaw primers, qosra wisq jew twal wisq mhumiex adattati għal sejbien ta 'PCR kwantitattiv fluworexxenti .Il-framment tal-prodott huwa qasir wisq biex jiġi distint mill-primer-dimer.It-tul tal-primer-dimer huwa madwar 30-40bp, u huwa diffiċli li ssir distinzjoni jekk huwiex primer-dimer jew prodott jekk ikun inqas minn 80bp.Jekk il-framment tal-prodott huwa twil wisq, jaqbeż it-300bp, faċilment iwassal għal effiċjenza baxxa ta 'amplifikazzjoni u ma jistax jikxef b'mod effettiv l-ammont tal-ġene.

Pereżempju, meta tgħodd kemm hemm nies fil-klassi, trid tgħodd biss kemm hemm ħalq.L-istess jgħodd meta tiskopri ġeni, għandek bżonn biss li tiskopri ċerta sekwenza ta 'ġene biex tirrappreżenta Is-sekwenza kollha se tagħmel.Jekk trid tgħodd in-nies, trid tgħodd kemm ħalq kif ukoll imnieħer, widnejn, u nuċċalijiet, u huwa faċli li tagħmel żbalji.

Biex tespandi, fir-riċerka bijoloġika, hemm ħafna każijiet ta 'riċerka minn punt għal żona, minħabba li s-sekwenza tal-ġeni ta' kwalunkwe speċi hija twila ħafna, mhuwiex meħtieġ u impossibbli li jitkejlu l-frammenti kollha, bħal sekwenzar batterjali 16S, li huwa li twettaq is-sekwenza konservattiva ta 'Assaġġi ta' batterji biex tiddeduċi n-numru ta 'ċerta popolazzjoni ta' batterji.

Q: X'inhu t-tul ottimali għad-disinn tal-primer qPCR?

Tweġiba: Ġeneralment, it-tul tal-primer huwa madwar 20-24bp, li huwa aħjar.Naturalment, irridu nagħtu attenzjoni għall-valur TM tal-primer meta niddisinjaw il-primer, minħabba li dan huwa relatat mat-temperatura ottimali ta 'ttemprar.Wara ħafna esperimenti, ġie ppruvat li 60 ° C huwa valur TM aħjar.Jekk it-temperatura ta 'l-ittemprar hija baxxa wisq, faċilment twassal għal amplifikazzjoni mhux speċifika.Jekk it-temperatura tal-ittemprar tkun għolja wisq, l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tkun relattivament baxxa, il-quċċata tal-kurva tal-amplifikazzjoni tibda aktar tard, u l-valur CT se jittardja.

Q: Kif huwa l-metodu taż-żebgħa differenti mill-metodu tas-sonda?

Tweġiba: Metodu taż-żebgħaXi żebgħa fluworexxenti, bħal SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, eċċ., Ma jarmux dawl waħedhom, iżda se jarmu fluworexxenza wara li jorbtu mal-kanal minuri ta 'DNA bi stranded doppju.Għalhekk, fil-bidu tar-reazzjoni tal-PCR, il-magna ma tistax tiskopri s-sinjal fluworexxenti.Meta r-reazzjoni tilħaq l-istadju ta 'l-estensjoni ta' l-ittemprar, tinfetaħ il-linja doppja, u linja ġdida hija sintetizzata taħt l-azzjoni tad-DNA polymerase, u l-molekula fluworexxenti torbot mal-kanal minuri dsDNA.Hekk kif in-numru ta 'ċikli tal-PCR jiżdied, aktar u aktar żebgħa huma kkombinati ma' DNA bi stranded doppju, u s-sinjal fluworexxenti huwa wkoll imtejjeb kontinwament.Il-metodu taż-żebgħa jintuża prinċipalment fir-riċerka xjentifika.
PS: Oqgħod attent meta tagħmel l-esperiment, iż-żebgħa trid tiġi kkombinata mad-DNA tal-bniedem, oqgħod attent li tibdelha f'persuna fluworexxenti.

Metodu taż-żebgħa (xellug) Metodu tas-sonda (lemin)
PS: Oqgħod attent meta tagħmel l-esperiment, iż-żebgħa trid tiġi kkombinata mad-DNA tal-bniedem, oqgħod attent li tibdelha f'persuna fluworexxenti.

SYBR Green Ⅰ jorbot mal-kanal minuri tad-DNA

Metodu tas-sondaIs-sonda Taqman hija s-sonda tal-idroliżi l-aktar użata b'mod komuni.Hemm grupp fluworexxenti fit-tarf 5′ tas-sonda, normalment FAM, u s-sonda nnifisha hija sekwenza kumplimentari għall-ġene fil-mira.Hemm grupp ta 'quenching fluworexxenti fit-tarf 3'.Skont il-prinċipju tat-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza (Förster resonance energy transfer, FRET), meta l-grupp fluworexxenti reporter (molekula fluworexxenti donatur) u l-grupp fluworexxenti li jkessaħ (molekula fluworexxenti aċċettatur) huma eċċitati Meta l-ispettri jikkoinċidu u d-distanza tkun qrib ħafna (7-10nm), l-eċitazzjoni tal-molekula fluworexxenti, filwaqt li l-molekula fluworexxenti taċċetta, nce huwa mdgħajjef.Għalhekk, fil-bidu tar-reazzjoni tal-PCR, meta s-sonda tkun ħielsa u intatta fis-sistema, il-grupp fluworexxenti reporter mhux se jarmu fluworexxenza.Meta l-ittemprar, il-primer u s-sonda jorbtu mal-mudell.Matul l-istadju ta 'estensjoni, il-polimerażi kontinwament tisintetizza ktajjen ġodda.DNA polymerase għandha attività eżonukleażi 5′-3′.Meta tilħaq is-sonda, id-DNA polymerase se idrolizza s-sonda mill-mudell, tissepara l-grupp fluworexxenti reporter mill-grupp fluworexxenti quencher, u tirrilaxxa s-sinjal fluworexxenti.Peress li hemm relazzjoni waħda għal waħda bejn is-sonda u l-mudell, il-metodu tas-sonda huwa superjuri għall-metodu taż-żebgħa f'termini ta 'eżattezza u sensittività tat-test.Il-metodu tas-sonda jintuża prinċipalment fid-dijanjosi.

Q: X'inhi l-kwantifikazzjoni assoluta?X'inhi Kwantifikazzjoni Relattiva?

Tweġiba: Kwantifikazzjoni assoluta tirreferi għall-kalkolu tan-numru inizjali tal-kopja tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat bil-qPCR, bħal kemm hemm viruses HBV f'1ml ta 'demm.Ir-riżultat miksub bi kwantifikazzjoni relattiva huwa l-bidla fl-ammont tal-ġene fil-mira f'kampjun speċifiku relattiv għal kampjun ta 'referenza ieħor, u l-espressjoni tal-ġene hija regolata 'l fuq jew irregolata 'l isfel.

Q: L-ammont ta 'estrazzjoni ta' RNA, effiċjenza ta 'traskrizzjoni inversa, u effiċjenza ta' amplifikazzjoni jaffettwaw ir-riżultati sperimentali?
Q: Il-ħażna tal-kampjuni, ir-reaġenti tal-estrazzjoni, ir-reaġenti tat-traskrizzjoni inversa u l-konsumabbli li jittrasmettu d-dawl jaffettwaw ir-riżultati sperimentali?
Q: Liema metodu jista 'jikkoreġi d-dejta sperimentali?

Rigward dawn il-kwistjonijiet, aħna ser niddeskrivuhom fid-dettall fit-taqsimiet avvanzati u avvanzati hawn taħt.
2. Għarfien avvanzat

Fir-rigward tal-PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali, irridu nirrikonoxxu r-realtà li eluf ta 'karti ta' riċerka xjentifika jiġu ppubblikati kull sena, fosthom it-teknoloġija tal-PCR kwantitattiva fluworexxenti mhix numru żgħir.

Jekk ma jkunx hemm standard komuni biex jitkejjel l-esperiment PCR kwantitattiv fluworexxenti, ir-riżultati jistgħu jvarjaw ħafna.Għall-istess ġene ta ' l-istess speċi, bl-istess metodu ta ' l-ipproċessar, ir-riżultati ta ' l-iskoperta wkoll se jvarjaw ħafna, u se jkun diffiċli għal dawk li għadhom kif waslu biex jirrepetu l-istess riżultati.Inti Ħadd ma jaf liema hu tajjeb u liema huwa ħażin.

Dan ifisser li l-PCR kwantitattiv fluworexxenti hija teknoloġija iqarrqu jew teknoloġija mhux affidabbli?Le, huwa minħabba li l-PCR kwantitattiv fluworexxenti huwa aktar sensittiv u aktar preċiż, u ftit operazzjoni ħażina tipproduċi riżultati kompletament opposti.Telf żgħir huwa elf mil bogħod.L-awtur tal-artiklu jista’ jiġi ttorturat ripetutament mir-reviżuri.Fl-istess ħin, ir-reviżuri tal-ġurnal huma wkoll diffiċli biex jagħżlu minn riżultati sperimentali differenti.

Kollox ma 'kollox, li jindika nuqqas ta' kunsens f'esperimenti PCR f'ħin reali.Għal dan il-għan, xjenzati anzjani fl-industrija bdew jifformulaw standards,jeħtieġ li l-kontributuri jipprovdu xi dettalji meħtieġa dwar l-esperimenti u l-ipproċessar tad-dejta (inkluża d-dejta meħtieġa) fl-artikolu biex jilħqu dawn l-istandards .

Ir-reviżuri jistgħu jiġġudikaw il-kwalità tal-esperiment billi jaqraw dawn id-dettalji;qarrejja futuri jistgħu wkoll jużaw dan biex jirrepetu l-esperiment jew itejbu l-esperiment.Imbagħad ir-riżultati sperimentali miksuba b'dan il-mod huma mimlija b'informazzjoni, ta 'kwalità għolja, u użabbli.

MIBBI (Informazzjoni Minima għal Investigazzjonijiet Bijoloġiċi u Bijomediċi -http://www.mibbi.org) daħal fis-seħħ.MIBBI huwa proġett li jipprovdi standards għall-esperimenti.Huwa ppubblikat fin-natura.Dan il-proġett huwa mmirat għal diversi esperimenti bijoloġiċi, inklużi l-bijoloġija taċ-ċelluli, Microarray, qPCR li se niddiskutu issa, eċċ., u jipprovdi għal kull tip ta 'esperiment meta nissottomettu manuskritti.Dik l-informazzjoni għandha tiġi pprovduta l-ħin kollu.

Fil-proġett MIBBI, hemm żewġ artikoli relatati mal-PCR kwantitattiv fluworexxenti, jiġifieri:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – lingwa strutturata u gwida ta’ rappurtar għal data PCR kwantitattiva f’ħin reali;
·MIQE (Informazzjoni Minima għall-Pubblikazzjoni ta' Esperimenti PCR Kwantitattivi Real-Time) – informazzjoni minima għall-pubblikazzjoni ta' artikli dwar esperimenti PCR kwantitattivi f'ħin reali.
L-ewwel, ejja nitkellmu dwar RDML, l-ispeċifikazzjoni tat-terminoloġija.

Jekk ma jkunx hemm definizzjoni standard għal kollox, huwa impossibbli li tkompli d-diskussjoni, u huwa għalhekk li l-ispjegazzjoni tat-termini hija tant importanti fl-eżami.
It-terminoloġija użata fl-esperiment PCR kwantitattiv fluworexxenti tinkludi l-kontenut li ġej.QIAGEN għamel l-aħjar sommarju għalina.Dawn li ġejjin huma kollha niexfaoġġetti .

Kurva ta' amplifikazzjoni
Il-kurva ta 'amplifikazzjoni tirreferi għall-kurva magħmula matul il-proċess tal-PCR, bin-numru taċ-ċiklu bħala l-axxissa u l-intensità tal-fluworexxenza f'ħin reali matul ir-reazzjoni bħala l-ordinata.

Kurva ta 'amplifikazzjoni eċċellenti għandu jkollha l-karatteristiċi li ġejjin: il-linja bażi hija ċatta jew ftit imnaqqsa, u m'hemm l-ebda tendenza ovvja 'l fuq;il-punt ta 'inflessjoni tal-kurva huwa ċar, u l-inklinazzjoni tal-fażi esponenzjali hija proporzjonali għall-effiċjenza tal-amplifikazzjoni.Iktar ma tkun kbira l-inklinazzjoni, iktar tkun għolja l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni;il-kurva tal-amplifikazzjoni ġenerali Il-paralleliżmu huwa tajjeb, li jindika li l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni ta 'kull tubu hija simili;il-fażi esponenzjali tal-kurva ta 'amplifikazzjoni ta' kampjuni b'konċentrazzjoni baxxa hija ovvja.

Linja bażi (Linja bażi)
Il-linja bażi hija l-livell tal-ħoss taċ-ċiklu bikri, normalment imkejla bejn it-3 u l-15-il ċiklu, minħabba li ż-żieda fil-valur tal-fluworexxenza kkawżata mill-prodott ta 'amplifikazzjoni ma tistax tiġi skoperta matul dan il-perjodu.In-numru ta' ċikli użati biex tiġi kkalkulata l-linja bażi jista' jiġi varjat u jista' jkun jeħtieġ li jitnaqqas jekk jintużaw ammonti ta' template għoljin jew jekk il-livell ta' espressjoni tal-ġene fil-mira huwa għoli.

L-issettjar tal-linja bażi jeħtieġ li tara d-dejta tal-fluworexxenza mill-kurva tal-amplifikazzjoni tal-linearità.Il-linja bażi hija ssettjata sabiex it-tkabbir tal-kurva ta 'amplifikazzjoni jibda b'numru taċ-ċiklu akbar min-numru ta' fuq taċ-ċiklu tal-linja bażi.Linji bażi jeħtieġ li jiġu stabbiliti individwalment għal kull sekwenza fil-mira.Il-valuri medji tal-fluworexxenza misjuba fiċ-ċikli bikrija jeħtieġ li jitnaqqsu mill-valuri tal-fluworexxenza miksuba fil-prodotti amplifikati.L-aħħar verżjonijiet ta 'diversi softwer tal-PCR Real-Time jippermettu ottimizzazzjoni awtomatika tas-settings tal-linja bażi għal kampjuni individwali.

Matul l-ewwel ftit ċikli tar-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni tal-PCR, is-sinjal tal-fluworexxenza ma jinbidilx ħafna.Li toqrob lejn linja dritta tissejjaħ il-linja bażi, imma jekk inħarsu mill-qrib lejn l-ewwel ftit ċikli, naraw li fil-linja bażi hemm dak li qed jiġri fl-istampa hawn taħt.

Sfond Sfond jirreferi għal
il-valur mhux speċifiku tal-fluworexxenza fir-reazzjoni.Per eżempju: tkessiħ tal-fluworexxenza ineffiċjenti;jew numru kbir ta 'mudelli tad-DNA double-stranded minħabba l-użu ta' SYBR Green.Il-komponenti tal-isfond tas-sinjal jitneħħew matematikament mill-algoritmu tas-softwer Real-Time PCR.

Sinjal tar-reporter
Is-sinjal tar-reporter jirreferi għas-sinjal fluworexxenti ġġenerat minn SYBR Green jew sondi speċifiċi għas-sekwenza ttikkettjati b'mod fluworexxenti waqt PCR Real-Time.

Sinjal ta' Reporter Normalizzat (RN)
RN jirreferi għall-intensità tal-fluworexxenza taż-żebgħa reporter diviża bl-intensità tal-fluworexxenza taż-żebgħa ta 'referenza passiva mkejla f'kull ċiklu.

Żebgħa ta' Referenza Passiva
F'xi PCRs f'ħin reali,iż-żebgħa fluworexxenti ROX tintuża bħala referenza interna biex tinnormalizza s-sinjal fluworexxenti.Tikkoreġi għal varjazzjonijiet minħabba pipetta mhux preċiża, pożizzjoni sew, u fluworexxenza fuq bażi bir-bir.

Il-limitu tal-fluworexxenza (limitu)
ġie aġġustat 'il fuq mill-valur tal-isfond u b'mod sinifikanti taħt il-valur tal-plateau tal-kurva tal-amplifikazzjoni.Għandu jkun fir-reġjun lineari tal-kurva ta 'amplifikazzjoni, li tirrappreżenta l-firxa log-lineari ta' skoperta PCR.Il-limiti għandhom jiġu stabbiliti fil-vista tal-kurva tal-amplifikazzjoni log sabiex il-fażi log-lineari tal-PCR tkun faċilment identifikabbli.Jekk ikun hemm diversi ġeni fil-mira fil-PCR Real-Time, il-limitu għandu jiġi stabbilit għal kull mira.Ġeneralment, is-sinjal tal-fluworexxenza tal-ewwel 15-il ċiklu ta 'reazzjoni tal-PCR jintuża bħala s-sinjal fl-isfond tal-fluworexxenza, u l-limitu tal-fluworexxenza huwa 10 darbiet id-devjazzjoni standard tas-sinjal tal-fluworexxenza tal-ewwel 3 sa 15-il ċiklu tal-PCR, u l-limitu tal-fluworexxenza huwa stabbilit fil-fażi esponenzjali tal-amplifikazzjoni tal-PCR.B'mod ġenerali, kull strument għandu l-limitu tal-fluworexxenza tiegħu stabbilit qabel l-użu.

Limitu taċ-Ċiklu (CT) jew Punt ta' Qsim (CP)
Iċ-ċiklu li fih il-kurva tal-amplifikazzjoni taqsam il-limitu (jiġifieri, il-punt li fih l-iskoperta tal-fluworexxenza tiżdied b'mod sinifikanti).CT jista 'jkun frazzjoni u l-ammont ta' mudell tal-bidu jista 'jiġi kkalkulat.Il-valur CT jirrappreżenta n-numru ta 'ċikli esperjenzati meta s-sinjal fluworexxenti f'kull tubu ta' reazzjoni PCR jilħaq il-limitu stabbilit.Hemm relazzjoni lineari bejn il-valur CT ta' kull mudell u l-logaritmu tan-numru inizjali tal-kopja tal-mudell, il-ogħla n-numru inizjali tal-kopja, iżgħar ikun il-valur CT, u viċi versa.Tista' ssir kurva standard bl-użu ta' standard b'numru tal-kopja inizjali magħruf, fejn l-axxissa tirrappreżenta l-valur CT, u l-ordinata tirrappreżenta l-logaritmu tan-numru inizjali tal-kopja.Għalhekk, sakemm jinkiseb il-valur CT tal-kampjun mhux magħruf, in-numru inizjali tal-kopja tal-kampjun jista 'jiġi kkalkulat mill-kurva standard.

Valur ΔCT
ΔCT valur jiddeskriviid-differenza bejn il-ġene fil-mira u l-valur CT tal-ġene ta 'referenza endoġenu korrispondenti, bħal ġene tad-dar, u huwa użat biex jinnormalizza l-ammont ta 'mudell użat:
⇒ΔCT = CT (ġene fil-mira) – CT (ġene ta’ referenza endoġenu)

Valur ΔΔCT
Il-valur ΔΔCT jiddeskrivi d-differenza bejn il-valur medju ΔΔCT ta’ kampjun ta’ interess (eż., ċelloli stimulati) u l-valur medju ΔΔCT ta’ kampjun ta’ referenza (eż., ċelloli mhux stimulati).Il-kampjun ta' referenza jissejjaħ ukoll il-kampjun tal-kalibrazzjoni u l-kampjuni l-oħra kollha huma normalizzati għal dan għal kwantifikazzjoni relattiva:
⇒ΔΔCT = ΔCT medju (kampjun ta’ interess) – ΔCT medju (kampjun ta’ referenza)

Ġeni ta' referenza endoġeni (ġeni ta' referenza endoġeni)
Il-livelli ta 'espressjoni ta' ġeni ta 'referenza endoġeni, bħal ġeni tad-dar (ġeni tad-dar), ma jvarjawx bejn il-kampjuni.It-tqabbil tal-valuri CT tal-ġene ta’ referenza mal-ġene fil-mira jippermetti li l-livell ta’ espressjoni tal-ġene fil-mira jiġi normalizzat għall-ammont ta’ input RNA jew cDNA (ara t-taqsima dwar il-valuri ΔCT hawn fuq).

Ġeni ta' referenza interna korretti għaldegradazzjoni possibbli tal-RNA jew il-preżenza ta 'inibituri tal-enżimi fil-kampjuni tal-RNA, kif ukoll varjazzjonijiet fil-kontenut tal-RNA, effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa, irkupru tal-aċidu nuklejku, u tqandil tal-kampjun.Biex tagħżel il-ġene(i) ta 'referenza ottimali, immodifikajna l-algoritmu biex tippermetti l-għażla tiegħu tar-referenza ottimali dipendenti fuq l-issettjar sperimentali.

Kontroll intern
Sekwenza ta' kontroll li hija amplifikata fl-istess reazzjoni bħas-sekwenza fil-mira u ttestjata b'sonda differenti (jiġifieri, twettaq PCR duplex).Il-kontrolli interni spiss jintużaw biex jeskludu amplifikazzjonijiet falluti, bħal meta s-sekwenza fil-mira ma tiġix skoperta.
Kampjun ta' Kalibrazzjoni
Kampjun ta 'referenza (per eżempju, RNA purifikat minn linja taċ-ċelluli jew tessut) użat fi kwantifikazzjoni relattiva biex iqabbel il-kampjuni l-oħra kollha biex jiddetermina l-livell ta' espressjoni relattiva ta 'ġene.Il-kampjun tal-kalibrazzjoni jista 'jkun kwalunkwe kampjun, iżda ġeneralment huwa kontroll (per eżempju, kampjun mhux ittrattat jew kampjun minn ħin żero tal-esperiment).

Kontrolli pożittivi
uża reazzjonijiet ta 'kontroll ma'ammonti magħrufa ta 'mudell.Ħafna drabi jintużaw kontrolli pożittivi biex jiċċekkjaw li sett ta’ primer jew sett ta’ sondi ta’ primer qed jaħdem sew u li r-reazzjoni hija stabbilita b’mod korrett.

Ebda Kontroll Mudell (NTC)
Reazzjoni ta 'kontroll li fiha l-komponenti kollha meħtieġa tar-reazzjoni ta' amplifikazzjoni ħlief il-mudell, li normalment jiġi sostitwit bl-ilma.L-użu ta 'NTC jista' jsib il-kontaminazzjoni kkawżata minn kontaminazzjoni ta 'reaġent jew DNA barrani, u b'hekk jiżguraw l-awtentiċità u l-affidabbiltà tad-dejta ta' skoperta.L-amplifikazzjoni tal-kontroll NTC tindika kontaminazzjoni.

L-ebda kontroll RT (NRT)
Il-proċess ta 'estrazzjoni ta' RNA jista 'jkun fih DNA ġenomika residwa, li hija estremament ta' ħsara u hija l-ħati li taffettwa l-kwalità tad-dejta u l-ghadu naturali tal-qPCR, għalhekk meta tfassal esperimenti, għandha tkun iddisinjata biex tkabbar biss is-sejbien tal-RNA.Hemm żewġ modi, wieħed huwa li tiddisinja primers madwar introns, l-ieħor huwa li tneħħi kompletament id-DNA, liema waħda hija aħjar, li se tiġi diskussa aktar tard.Il-kontroll NTR huwa mera maġika biex tiskopri t-tniġġis tad-DNA.Jekk ikun hemm amplifikazzjoni, dan ifisser li hemm tniġġis.

Standards
L-istandards huma kampjuni ta' konċentrazzjoni magħrufa jew numru ta' kopji li jintużaw biex tinbena kurva standard.Sabiex tiġi żgurata l-istabbiltà tal-istandard, il-framment tal-ġeni ġeneralment jiġi kklonat fil-plasmid u jintuża bħala l-istandard.

Il-kurva standard
huwa ġeneralment dilwit f'mill-inqas 5 gradjenti ta 'konċentrazzjoni mal-prodott standard skond il-proporzjon ta' l-irduppjar, u 5 punti huma mfassla fil-koordinati tal-valur CT u n-numru tal-kopja, u l-punti huma konnessi biex jiffurmaw linja biex jiġġeneraw kurva standard.Għal kull kurva standard, il-validità tagħha trid tiġi ċċekkjata.Il-valur tal-inklinazzjoni jaqa' bejn –3.3 u –3.8, u kull konċentrazzjoni titwettaq fi tliet kopji.Punti li huma differenti b'mod sinifikanti minn punti oħra għandhom jintremew.Il-valur CT tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat jinġieb fil-kurva standard, u l-livell ta 'espressjoni tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat jista' jiġi kkalkulat.

Il-valur CT tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat jinġieb fil-kurva standard, u n-numru inizjali tal-kopja tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat jista 'jiġi kkalkulat.

Effiċjenza u Inklinazzjoni
L-inklinazzjoni tal-kurva standard tirrappreżenta l-effiċjenza tal-PCR f'ħin reali.
·Inklinazzjoni ta '-3.322 tindika li l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR hija 1, jew 100% effiċjenti, u l-ammont tal-prodott tal-PCR jirdoppja f'kull ċiklu.
·Inklinazzjoni inqas minn –3.322 (eż., –3.8) tindika effiċjenza tal-PCR
·Inklinazzjoni akbar minn –3.322 (eż., –3.0) tindika li l-effiċjenza tal-PCR tidher li hija akbar minn 100%, li hija kurjuża, kif jista 'ċiklu wieħed ta' PCR jiġġenera aktar mid-doppju tal-prodott amplifikat?Din is-sitwazzjoni sseħħ fil-fażi mhux lineari tar-reazzjoni tal-PCR, jiġifieri, hemm ammont kbir ta 'amplifikazzjoni mhux speċifika.

kurva tat-tidwib
Wara li titlesta l-amplifikazzjoni tal-qPCR, il-prodott tal-PCR jissaħħan.Hekk kif it-temperatura togħla, il-prodott ta 'amplifikazzjoni b'linja doppja jiddewweb gradwalment, li jirriżulta fi tnaqqis fl-intensità tal-fluworexxenza.Meta tintlaħaq ċerta temperatura (Tm), numru kbir ta 'prodotti jiddewweb.Il-fluworexxenza tonqos drastikament.Prodotti differenti tal-PCR għandhom valuri Tm differenti u temperaturi ta 'tidwib differenti, sabiex l-ispeċifiċità tal-PCR tkun tista' tiġi identifikata.

Kurva tat-tidwib (kurva derivata)
Il-kurva tat-tidwib hija derivata biex tifforma mappa tal-quċċata, li tista 'turi b'mod aktar intuwittiv is-sitwazzjoni tal-frammenti tal-prodott tal-PCR.Peress li t-temperatura tat-tidwib hija l-valur Tm tal-framment tad-DNA, jistgħu jiġu ġġudikati xi parametri li jaffettwaw il-valur Tm tal-framment tad-DNA, bħad-daqs tal-framment, il-kontenut GC, eċċ B'mod ġenerali, skond il-prinċipji tad-disinn primer tagħna,it-tul tal-prodott amplifikat huwa fil-medda ta '80-300bp, għalhekk it-temperatura tat-tidwib għandha tkun bejn 80°C u 90°C.

Interpretazzjoni tal-kurva tat-tidwib: Jekk l-uniku quċċata prinċipali tidher bejn 80 ° C-90 ° C, dan ifisser li l-PCR kwantitattiv fluworexxenti huwa perfett;jekk il-quċċata prinċipali tidher bejn 80°C-90°C u qċaċet mixxellanji jidhru taħt 80°C, id-dimer tal-primer huwa bażikament ikkunsidrat.Tista 'tipprova żżid it-temperatura ta' l-ittemprar biex issolviha;jekk il-quċċata prinċipali tidher bejn 80°C-90°C, u l-quċċata mixxellanja terġa' tidher meta t-temperatura togħla, bażikament jitqies li hemm kontaminazzjoni tad-DNA, u d-DNA jeħtieġ li jitneħħa fl-istadju inizjali tal-esperiment.

Naturalment, għad hemm xi sitwazzjonijiet anormali, li se jiġu mqassma waħda waħda hawn taħt.
3. Għarfien avvanzat

Biex tagħmel qPCR, irrid ngħid MIQE,Informazzjoni Minimagħall-Pubblikazzjoni ta'KwantitattivPCR f'ħin realiEsperimenti —l-informazzjoni minima għall-pubblikazzjoni ta' artikli dwar PCR kwantitattiv f'ħin realiesperimenti.Sabiex nissimplifikaw il-fehim ta 'kulħadd, aħna se nissimplifikaw il-kontenut ewlieni.

Tista 'tfittex it-test oriġinali ta' MIQE fuq l-Internet, u l-iktar ħaġa importanti hija li tistipula l-lista ta’ kontroll tad-dejta li trid tiġi pprovduta meta jiġi ppubblikat artiklu .

Ir-reviżuri jistgħu jiġġudikaw il-kwalità tal-esperiment billi jaqraw dawn id-dettalji;qarrejja futuri jistgħu wkoll jużaw dan biex jirrepetu jew itejbu l-esperiment.
Ta’ min jinnota li f’din il-lista, l-importanza ta’ kull lista hija mmarkata b’E jew D rispettivament.Xi tfisser?E: informazzjoni essenzjali (għandha tiġi sottomessa);D: informazzjoni mixtieqa (tipprovdi kemm jista' jkun).

MIQE (1)—Disinn Sperimentali
Ħafna scumbags li temmew id-difiża tagħhom wara li temmew l-istudji gradwati tagħhom ma jkunux jafu kif ifasslu esperiment b'mod indipendenti, jiftħu n-notebooks tagħhom, u jagħmlu dak li jgħidilhom l-għalliem.Bħala riżultat, id-disinn sperimentali ma kienx rigoruż, u d-dipartiment editorjali tar-rivista qal li riedu jagħmlu din l-istampa u dik l-istampa, u għalhekk għamluha f'daze.Hekk isiru l-iskumbags!

Eqreb lejn id-dar, l-ewwel prinċipju tal-esperiment huwa li jiddeterminair-rigorożità tal-loġika sperimentali.L-iktar ħaġa fundamentali hija d-disinn sperimentali, u l-iktar ħaġa importanti dwar id-disinn sperimentali hija kif jiġu stabbiliti l-kampjun fil-mira, il-kampjun ta 'referenza (kontroll), u n-numru ta' repetizzjonijiet, sabiex id-dejta sperimentali tkun tista 'tiġi referenzjata, komparabbli u konvinċenti.

Il-kampjun fil-mirajirreferi għall-kampjun li jeħtieġ li niskopru l-ġene fil-mira wara ċertu trattament.Il-kampjun ta' referenzahuwa l-kampjun mingħajr ebda trattament, li spiss jissejjaħ tip selvaġġ fil-bijoloġija.

Repliki sperimentalihuma importanti ħafna.Ġeneralment, in-numru ta 'repliki persważivi għandu jkun aktar minn tlieta.Huwa meħtieġ li ssir distinzjoni x'inhi replikazzjoni bijoloġika u x'inhi replikazzjoni teknika.

Repliki Bijoloġiċi: L-istess esperiment ta 'verifika magħmul b'materjali differenti (ħin, pjanti, lottijiet, pjanċi ta' reazzjoni).

Duplikazzjoni bijoloġika
Ejja nieħdu t-trattament tal-pestiċidi tal-bżar bħala eżempju.Irridu nisprejjaw il-pestiċidi fuq it-tliet pjanti ta 'ABC, allura t-tliet pjanti ta' ABC huma tliet repliki bijoloġiċi, u huma l-istess esperiment ta 'verifika mwettqa b'materjali differenti.Iżda bħala esperiment, kontroll huwa definittivament meħtieġ, sabiex inkunu nistgħu roxx waħda mill-fergħat tal-pjanta A biex jiffurmaw grupp sperimentali tal-pjanta A, u mhux sprejja l-fergħat l-oħra tal-pjanta A biex jiffurmaw grupp ta 'kontroll.Agħmel l-istess għal B u C.

Repliki Tekniċi (Repliki Tekniċi): Huwa esperiment ripetut iddisinjat biex jevita żbalji kkawżati mill-operazzjoni, li fil-fatt hija toqba duplikata inkluża fl-istess materjal.Kemm it-trattamenti kif ukoll il-kontrolli għandu jkollhom settings replikati (minimu tlieta) tal-ġene fil-mira u l-ġene ta’ referenza interna.

Ripetizzjoni teknika
Erġa' ħu l-bżar trattat bil-pestiċidi bħala eżempju.Għall-grupp sperimentali tal-pjanta A, għamilna tliet toqob PCR ta '1, 2, u 3 għall-ġene fil-mira u l-ġene ta' referenza interna tiegħu rispettivament, sabiex tieħu l-medja wara l-iskoperta.Għall-kontroll tal-impjant A Gruppi huma wkoll ittrattati bl-istess mod.Bl-istess mod, agħmel l-istess trattament għall-pjanti B u C.Din hija ripetizzjoni teknika.

Ta’ min jinnota lidak li jidħol fl-istatistika huwa r-ripetizzjoni bijoloġika, u r-ripetizzjoni teknika hija li tittestja jekk hemmx xi fenomeni każwali fil-proċess sperimentali, sabiex ir-riżultati sperimentali jkunu kredibbli, jiġifieri, biex jiġu evitati żbalji billi tieħu l-medja tagħhom kif spiss ngħidu.

Kontrolli Negattivi — NTC u NRT
NTC (Kontroll mingħajr Template), kontroll mingħajr mudell, jintuża biex jivverifika jekk il-materjal sperimentali huwiex ikkontaminat.Ġeneralment, l-ilma jintuża bħala mudell.Jekk ikun hemm reazzjoni fluworexxenti, tindika li l-kontaminazzjoni tal-aċidu nuklejku seħħet fil-laboratorju.

Dan it-tniġġis ġej minn: ilma impur, reaġenti mhux kwalifikati li fihom DNA endoġenu, tniġġis tal-primer, tniġġis ta 'tagħmir tal-laboratorju, tniġġis ta' aerosol, eċċ., Jeħtieġ li tuża kenniesi RNase u inibituri RNase.It-tniġġis bl-ajrusol huwa l-aktar diffiċli biex jinstab.Immaġina li l-laboratorju tiegħek huwa bħal smog, b'diversi aċidi nuklejċi sospiżi fl-arja.

NRT (No-Reverse Transcriptase), il-kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa, huwa l-RNA traskritt mhux invers bħala kontroll negattiv, li huwa l-kontroll tar-residwu tal-gDNA.

Meta tagħmel l-espressjoni tal-ġeni, l-ammont ta 'RNA jiġi skopert billi jinstab l-ammont ta' cDNA wara traskrizzjoni inversa.Jekk ikun hemm residwu tal-gDNA meta l-RNA jiġi ppurifikat, dan jikkawża żbalji fir-riżultati sperimentali, minħabba li r-riżultati attwali miksuba huma gDNA u cDNA.Fil-livell aggregat, mhux biss cDNA, gDNA jeħtieġ li jitneħħa kompletament waqt l-estrazzjoni tal-RNA.

MIQE (2)—kampjun ta' informazzjoni
L-hekk imsejħa informazzjoni tal-kampjun tfisser li meta nippubblikaw artiklu dwar qPCR, irridu nispjegaw l-informazzjoni tal-kampjun b'mod ċar, li hija parti indispensabbli tal-artikolu.Bl-istess mod, meta nipproċessaw kampjuni, irridu nirregolaw ukoll l-operazzjonijiet tagħna stess biex niżguraw il-validità tal-kampjuni.

Id-deskrizzjoni tal-kampjun hija biss riżultat, u għandna nagħtu aktar attenzjoni lill-materjali meħuda matul l-esperiment kollu.

Għażla ta 'materjali sperimentali
Kampjuni tad-demm - agħżel demm frisk, mhux aktar minn 4 sigħat.Kampjuni taċ-ċelluli - agħżel li tiġbor ċelluli friski f'perjodu ta 'tkabbir qawwi.Tessut tal-Annimali—Agħżel tessut frisk u li qed jikber b'mod vigoruż.Tessut tal-Pjanti - Agħżel tessut frisk u żagħżugħ.

Għandek tkun innotajt li hemm kelma ewlenija f’dawn il-ftit sentenzi: frisk .
Għall-kampjuni ta 'hawn fuq, l-aħjar kit, kost-effettiv u stabbli fis-suq huwa l-kit ta' Foregene, li jista 'jiġbed malajr u faċilment id-DNA u l-RNA tagħhom.

Mini Kit tad-DNA tad-Demm

Kit ta' iżolament ta' RNA totali taċ-ċelluli

Kit ta' iżolament ta' l-RNA totali ta' l-Annimali

Kit tal-Iżolament tal-RNA Totali tal-Pjanti

Pjanti Total RNA Isolation Kit Plus

Kit tal-Iżolament tad-DNA tal-Pjanti

Ħażna ta 'materjali sperimentali
B'mod ġenerali, aħna ma nirrakkomandawx li taħżen kampjuni, jekk il-kundizzjonijiet jippermettu.Madankollu, hemm ħafna ħbieb li ma jistgħux iwettqu esperimenti immedjatament wara t-teħid tal-kampjuni, u xi wħud saħansitra jeħtieġu iġorru tankijiet tan-nitroġenu likwidu fil-qasam għat-teħid tal-kampjuni.

Għal dan it-tip ta 'ħabib li jaħdem iebes, nista' ngħid biss li ma tifhimx konsumabbli tar-reaġent.Issa ħafna kumpaniji konsumabbli tar-reaġenti jipproduċu reaġenti li jistgħu jaħżnu kampjuni ta 'RNA f'temperatura tal-kamra, u tista' tagħżel li tużahom.Il-metodu ta 'ħażna konvenzjonali huwa ħażna ta' nitroġenu likwidu, bl-użu ta 'tank żgħir ta' nitroġenu likwidu li huwa faċli biex iġorr.Wara li ġġib il-kampjun lura fil-laboratorju, aħżen fi friġġ -80°C.

Għal esperimenti li jinvolvu l-RNA, il-prinċipju ta' sitt kelmiet għandu jiġi segwit:temperatura baxxa, l-ebda enzimi,umalajr .

Il-kunċett ta 'temperatura baxxa huwa faċli biex jinftiehem;mingħajr enzimi, RNase jinsab kullimkien fid-dinja li ngħixu fiha (inkella kont inqatel bl-HIV), allura kif tevita RNase meta tagħmel esperimenti huwa kunċett importanti ħafna;malajr,M'hemm l-ebda Kung Fu fid-dinja li ma jistax jitkisser, il-veloċità biss ma tistax tinkiser.

Għalhekk, f'ċertu sens, l-iqsar il-ħin ta 'estrazzjoni, l-aħjar il-kit.Għaliex maForegeneIl-kit jenfasizza l-veloċità, għax jafuha sew.

PS: Xi bniet jagħmlu esperimenti b'attenzjoni kbira, iżda mhumiex tajbin daqs slam dunk wara diversi snin ta 'xogħol.Huma jħossu li Alla huwa inġust, jilmenta dwar oħrajn, u jfittex il-ħajja.Fil-fatt, hija ma fehimhiex.Huwa ma jipproteġix l-RNA sew, u l-plejer slam dunk kien nimble.Meta kien qed jagħmel l-esperiment, ħaseb li se jispiċċa s-slam dunk bi tliet darbiet, ħames darbiet u żewġ diviżjonijiet, iżda għamel l-esperiment tajjeb.

Nota: Aktar bil-mod, aktar ċansijiet ta 'invażjoni RNase.Kif tħarreġ lilek innifsek biex tkun veloċi?M'hemm l-ebda mod, biss prattika aktar.

Għal esperimenti differenti u kampjuni differenti, għadu meħtieġ li taqra aktar letteratura u tagħżel metodu xieraq għall-ipproċessar.Għall-proċess tal-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni, MIQE jeħtieġ li għandu jkun miktub b'mod ċar fil-karta, sabiex ir-reviżuri jkunu jistgħu jirrevedu l-affidabilità tal-karta, u huwa wkoll konvenjenti għaż-żgħażagħ storduti jirrepetu l-esperiment tiegħek.

Għalkemm l-esperimenti bijoloġiċi huma diffiċli, huma high-end.Jekk ma toqgħodx attent, tista’ taqleb id-dinja.Per eżempju, tagħmel SARS fi kriżi bijokimika, jew tagħmel ross ibridu biex issalva 1.3 biljun ruħ.L-istampa t'hawn taħt hija esperiment kimiku, għandek tifhem kemm int kburi bir-riċerka tiegħek billi tħares biss lejn id-dehra tiegħu bħal Dick.Tinsa, tiswedx lilu.

MIQE (3) – estrazzjoni ta' aċidu nuklejku.
L-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku hija avveniment kbir, u l-esperimenti kollha tal-bijoloġija molekulari jibdew bl-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku.L-ewwelnett, ejja nikkopja l-kontenut tal-MIQE dwar l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku.

Meta wieħed iħares lejn din il-formola, ma tistax toqgħod fuq il-wiċċ.Il-forma hija dogma.Biex tkun student mill-aqwa, trid tistaqsi għaliex.Il-kontenut essenzjali ta' din it-tabella huwa: Issegwiil-purità, l-integrità, il-konsistenza, u l-ammont ta 'estrazzjoni ta' RNA .

L-ewwel parti tal-proċess jew strument huwa l-pass ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku.Jekk tuża estrattur awtomatiku tal-aċidu nuklejku biex tiġbed (avvanzat, jekk jogħġbok ikkuntattjani għax-xiri), għandek bżonn tindika l-isem tal-mudell tal-istrument.

L-isem tal-kit u

liema kit intuża għad-dettalji tal-bidla, liema reaġenti speċjali ġew miżjuda jew liema operazzjonijiet speċjali saru għandhom jiġu spjegati b'mod ċar sabiex oħrajn ikunu jistgħu jirrepetu l-esperiment tiegħek faċilment.

Xi nies iżidu xi reaġenti speċjali meta jiġu estratti kampjuni speċjali, billi jaħsbu li din hija l-arma sigrieta tagħhom u ma tgħidx lil ħaddieħor.Filwaqt li jżommuha sigrieta, huma wkoll jitilfu l-opportunità li jagħmlu l-artiklu tiegħek shine.M'għandekx tkun għaqlija, trid tkun aktar onest mill-pajjiż qodma Zhang fir-riċerka xjentifika, jekk trid tkun għaqlija, l-artikolu se tagħmlek stupid.

trid tiftakar in-numru tal-prodott tal-kitmeta tordna l-kit u tikteb l-artiklu.Ġeneralment hemm żewġ numri fuq il-kit: Cat—numru tal-katalogu (numru tal-prodott, numru tal-artikolu), Lott—numru tal-lott tal-prodott (Użat biex jindika minn liema lott ġie l-prodott).

Barra minn hekk, in-numru CAS huwa spiss użat meta tordna reaġenti bijokimiċi, u jien se popularize flimkien.In-numru CAS huwa n-numru mogħti mill-American Chemical Society għal kull droga kimika ġdida.Ġeneralment, tliet numri huma konnessi b'sing.Numru CAS ta' Rushui: 7732-18-5.Is-sustanzi kimiċi ħafna drabi jkollhom psewdonimi multipli, iżda n-numru CAS huwa uniku.Meta tordna mediċina, tista' tiċċekkja n-numru CAS tagħha l-ewwel.

Eqreb tad-dar, għala għandna niddeskrivu dawn l-affarijiet b’mod ċar?Fil-fatt, huwa wkoll biex tiċċekkja l-kwalità tal-estrazzjoni tal-RNA.L-użu ta 'strumenti u kits se jagħmel l-estrazzjoni tal-RNA aktar konsistenti.L-iskala ta 'estrazzjoni tal-laboratorji ordinarji mhix kbira, u tista' tinkiseb b'kits.

Id-dettalji tat-trattament b'DNase jew RNase
Il-kwistjoni importanti tal-PCR kwantitattiv fluworexxenti hija li tipprevjeni l-kontaminazzjoni tad-DNA, u ma tesperimentax jekk ikun hemm kontaminazzjoni.Għalhekk, huwa imperattiv li tiddikjara l-proċess li użajt biex tipproċessa d-DNA, sabiex turi li d-DNA fil-proċess sperimentali tneħħa kompletament u kompletament.rappreżentat minn dijagramma skematika.

Dijagramma skematika ta 'RNA u DNA....
B'mod ġenerali, il-metodu għat-tneħħija tad-DNA huwa li tiġi ttrattata RNA b'DNase wara l-estrazzjoni.Madankollu, dawn huma metodi relattivament antiki.Kits kummerċjali ta 'estrazzjoni ta' RNA setgħu jneħħu d-DNA matul il-proċess ta 'estrazzjoni mingħajr ma jżidu DNase.Per eżempju, serje ta 'kits minn Foregene.

Nota: It-tneħħija tad-DNA waqt l-estrazzjoni tal-RNA hija xabla doppja perikoluża ħafna, li ttawwal il-ħin tal-operat tal-estrazzjoni tal-RNA u żżid ir-riskju ta 'degradazzjoni tal-RNA.Bażikament, huwa kompromess bejn il-produzzjoni tal-RNA u l-purità.

Barra minn hekk, l-ammont ta 'DNase miżjud mal-kolonna ta' adsorbiment ibbażata fuq is-silika huwa żgħir ħafna, u DNase ta 'kwalità għolja għandu jintuża biex jinkiseb l-effett.DNase mhux ottimizzat ma jistax jiġi diġerit malajr u kompletament.Dan huwa test tal-livell tekniku tan-negozjant.Naturalment, hemm saħansitra aktar negozjanti strambi li jiftaħar li d-DNA jista 'jitneħħa mingħajr DNase.Jista 'jingħad li kull min jiftaħar li d-DNA jista' jitneħħa kompletament mingħajr DNase huwa hooligan.Id-DNA hija struttura relattivament stabbli double-stranded, u ma tistax tinħass biss billi titkellem u tidħaq.

Valutazzjoni ta' kontaminazzjoni
metodu ta 'valutazzjoni: sejbien ta' elettroforeżi, 1% agarose, 6V/cm, 15min, tagħbija 1-3 ul

Analiżi kwantitattiva tal-aċidu nuklejku
normalment titkejjel bl-użu ta’ spettrofotometru UV.Ħallini l-ewwel popolarizza t-tifsira tat-tliet valuri ta 'OD260, OD280, u OD230.
·OD260nm: Huwa l-wavelength ta 'assorbiment ta' l-ogħla quċċata ta 'assorbiment ta' aċidu nuklejku, u l-aħjar valur imkejjel ivarja minn 0.1 sa 1.0.Jekk le, iddilwa jew ikkonċentra l-kampjun biex iġġib fil-medda.
·OD280nm: Huwa l-wavelength ta 'assorbiment ta' l-ogħla quċċata ta 'assorbiment ta' proteini u sustanzi fenoliċi.
·OD230nm: Huwa l-wavelength ta 'assorbiment ta' l-ogħla quċċata ta 'assorbiment ta' karboidrati.

Sussegwentement, ejja nitkellmu dwar ir-rwol ta 'kull indikatur.Għal A260, jista 'jintuża biex ikejjel ir-rendiment ta' aċidu nuklejku.Meta OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Għall-purità, irridu nħarsu lejn il-proporzjonijiet li naraw b'mod komuni: OD260/280 u OD260/230.
·DNA pur: OD260/280 huwa bejn wieħed u ieħor ugwali għal 1.8.Meta jkun akbar minn 1.9, jindika li hemm tniġġis RNA, u meta jkun inqas minn 1.6, jindika li hemm tniġġis ta 'proteini u fenol.
·RNA pur: 1.7
·OD260/230: Kemm jekk huwa DNA jew RNA, il-valur ta 'referenza huwa 2.5.Meta jkun inqas minn 2.0, jindika li hemm tniġġis taz-zokkor, melħ u materja organika.

Integrità tal-RNA

Huwa importanti ħafna li titkejjel l-integrità tal-RNA.Ġeneralment, huwa meħtieġ li jsir esperiment tal-ġel tad-denaturazzjoni tal-RNA biex tivverifika jekk il-luminożità bejn 28S u 18S RNA hijiex relazzjoni doppja.Meta tidher it-tielet faxxa 5S, dan ifisser li l-RNA beda jiddegrada, ħlief għall-invertebrati.

Dejta għall-valutazzjoni tal-kwalità tal-RNA: Minbarra t-testijiet ta 'hawn fuq, hemm ukoll xi testijiet tal-istrumenti aktar avvanzati f'termini tal-integrità tal-RNA, bħat-test tal-integrità RQI tas-sistema awtomatika tal-elettroforeżi Experion, li tista' tiskopri jekk l-RNA huwiex degradat b'mod inviżibbli.

Fir-riċerka xjentifika, il-PCR kwantitattiv fluworexxenti huwa paragun bejn il-ġene fil-mira u l-ġene ta 'referenza interna.Għalhekk, fil-proċess tal-preservazzjoni tal-kampjun tal-RNA, l-estrazzjoni tal-RNA, eċċ., L-għan primarju huwa li tiġi żgurata l-integrità tal-RNA.

Kif l-integrità ta 'RNA taffettwa l-bilanċ bejn il-ġene fil-mira u l-ġene ta' referenza interna jista 'jinftiehem faċilment mill-figura hawn taħt.Id-degradazzjoni se twassal għal nuqqas ta 'kompletezza tal-ġene, kemm jekk hija l-inkompletezza tal-ġene ta' referenza interna jew l-inkompletezza tal-ġene fil-mira, se jkollha impatt kbir fuq id-dejta.

Dijagramma skematika tal-ġene fil-mira u l-ġene ta 'referenza, m'għandhiex tkun vera

Test ta' inibizzjoni (jekk il-valur CT huwa mrażżan taħt konċentrazzjoni għolja jew baxxa jew kundizzjonijiet oħra)

Meta tieħu din il-figura bħala eżempju, il-valuri Ct tal-ħames kurvi huma kif ġej.Id-distribuzzjoni tal-valuri CT bejn il-kurvi hija irregolari, u l-valuri Ct jittardjaw taħt konċentrazzjonijiet għoljin u baxxi, li huwa l-każ ta 'inibizzjoni tal-PCR.

Punt ewlieni: Fil-proċess tal-estrazzjoni tal-RNA, jeħtieġ li nabbandunaw kunċetti żbaljati u nistabbilixxu dawk korretti.

L-idea ħażina hija: l-estrazzjoni tal-RNA ssegwi biss ir-rendiment, billi taħseb li iktar ma jkun kbir l-ammont ta 'RNA miksub, aħjar.Fil-fatt, meta nagħmlu l-kwantifikazzjoni, jekk in-numru ta 'ġeni ma jkunx kbir ħafna, m'għandniex bżonn ħafna RNA.L-ammont ta 'RNA li estratt huwa aktar minn biżżejjed.

Il-kunċett korrett huwa:L-estrazzjoni tal-RNA għandha ssegwi purità, integrità u konsistenza.Il-purità tista 'tiżgura li t-traskrizzjoni inversa sussegwenti ma tiġix inibita u d-dejta ma tiġix affettwata mid-DNA.L-integrità tiżgura l-bilanċ tas-sekwenzi fil-mira u r-referenzi interni.Il-konsistenza tiżgura tagħbija stabbli tal-kampjun.

MIQE (4) – traskrizzjoni inversa
Kunċett żbaljat: l-insegwiment ta 'volum ta' kampjun ogħla.
Kunċett korrett: Issegwi l-konsistenza (l-istabbiltà), irrispettivament mill-ammont ta 'RNA mgħobbi, l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa tibqa' konsistenti, u tiżgura li d-differenzi fis-cDNA jistgħu verament jirriflettu differenzi fl-mRNA.
Aħna nispjegaw dan il-proċess b'dijagramma skematika:

Dijagramma skematika tal-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa, ma tkunx vera
L-ewwelnett, irridu nifhmu d-differenza bejn il-proċess ta 'traskrizzjoni inversa u l-proċess tal-PCR.Il-PCR jgħaddi minn proċessi multipli ta 'tisħin u ttemprar, u l-framment fil-mira jikber b'mod esponenzjali;filwaqt li t-traskrizzjoni inversa m'għandhiex dan il-proċess, nistgħu nimmaġinaw li t-traskrizzjoni inversa hija fil-fatt waħda għal waħda Matul il-proċess ta 'replikazzjoni, daqstant biċċiet ta' RNA

kif hemm jistgħu jiksbu kemm biċċiet ta 'Informazzjoni cDNA, għandu jkun mifhum sa issa, minħabba frammenti kbar u żgħar ġew traskritti b'lura, u huwa impossibbli li tiffoka fuq framment wieħed.U minħabba li l-ammont ta 'RNA huwa relattivament żgħir, l-ammont ta' cDNA miksub huwa wkoll relattivament żgħir, b'differenza mill-PCR, li għandu effett ta 'amplifikazzjoni, għalhekk huwa bażikament impossibbli li jinstab.

Ir-riżultati tal-elettroforeżi tal-cDNA
It-tieni, idealment, it-traskrizzjoni inversa ssir waħda għal waħda, iżda l-ebda transcriptase inversa minn kwalunkwe kumpanija ma tista 'tikseb dan l-effett.Bażikament, l-effiċjenza tal-biċċa l-kbira tar-reverse transcriptases wanders bejn 30-50%.Jekk dan huwa l-każ, nippreferu jkollna effiċjenza ta 'traskrizzjoni inversa relattivament stabbli, li huwa dak li rridu naraw fil-figura: 3 RNAs jiksbu 2 cDNAs, 6 RNAs jiksbu 4 cDNAs, għalhekk ma jimpurtax kemm ikun mgħobbi kampjun, l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hija relattivament stabbli.Ma rridux naraw is-sitwazzjoni fejn l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hija instabbli u konċentrazzjoni għolja hija inibita.

Allura, kif tivverifika jekk l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hijiex stabbli?Il-metodu huwa sempliċi ħafna, għandek bżonn biss li tagħmel test ta 'tqabbil: wieħed huwa li traskrivi b'lura f'cDNA wara li tirdoppja d-dilwizzjoni tal-RNA, u l-oħra hija li tagħmel dilwizzjoni li tirdoppja wara t-traskrizzjoni b'lura f'cDNA, u mbagħad tagħmel qPCR biex tara l-inklinazzjoni miksuba Huwa konsistenti.Bħala student top, għandek tifhimha f'sekondi.Kif muri hawn taħt:

Dilwizzjoni ta 'RNA u cDNA biex tittestja jekk l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hijiex stabbli
Reverse transcriptase u kit
Kif jista 'PCR kwantitattiv fluworexxenti perfetta jkollu reverse transcriptase u kit eċċellenti.Reverse transcriptase huwa bejn wieħed u ieħor maqsum f'żewġ tipi skond is-sors, AMV jewM-MLV, u l-prestazzjoni tagħhom hija l-istess bħal dik murija fit-tabella.

Attività RNase H
RNase H huwa Ribonuclease H, l-isem Ċiniż huwa ribonuclease H, li huwa endoribonuclease li jista 'speċifikament idrolizza RNA fil-katina ibrida DNA-RNA.RNase H ma jistax idrolizza r-rabtiet tal-fosfodiesteru f'DNA jew RNA b'linja waħda jew b'linja doppja, jiġifieri, ma tistax tiddiġerixxi DNA jew RNA b'linja waħda jew doppja.Użat komunement fis-sintesi tat-tieni linja ta 'cDNA.

Hija ħaġa stramba.Aħna ngħidu li reverse transcriptase għandha attività RNase H, mhux li reverse transcriptase fiha RNase H, u jista 'ma jkunx possibbli li tissepara RNase H minn reverse transcriptase, forsi minħabba l-konformazzjoni ta' ċerti gruppi fir-reverse transcriptase Din l-attività hija kkawżata mir-reverse transcriptase.

Għalhekk, irrispettivament mill-effiċjenza ogħla tat-traskrizzjoni inversa ta 'AMV, l-attività RNase H tagħha tnaqqas ir-rendiment ta' cDNA.Naturalment, il-manifatturi tar-reaġenti qed jottimizzaw il-prodotti tagħhom b'mod kostanti biex jeliminaw l-attività ta 'RNase H f'reverse transcriptase kemm jista' jkun biex iżidu r-rendiment ta 'cDNA.
Temperatura tat-ttemprar

Struttura sekondarja ta 'RNA f'temperaturi differenti
Ara l-figura ta 'hawn fuq għall-istruttura sekondarja tal-RNA f'temperaturi differenti, u uża l-għodda onlajn mFold biex tiddetermina l-istruttura sekondarja tal-framment fil-mira taħt kundizzjonijiet speċifiċi ta' konċentrazzjoni ta 'temperatura u melħ.F'55 ° C, l-istruttura sekondarja tal-RNA għadha kumplessa ħafna, reverse transcriptase ma tistax taħdem, u l-istruttura sekondarja ma tistax tiġi solvuta kompletament sa 65 ° C, filwaqt li t-temperatura ottima ta 'AMV u M-MLV hija ferm aktar baxxa minn din it-temperatura.
X'tagħmel?L-istruttura sekondarja hija t-tqabbil kumplimentari tal-mudell innifsu, li jwassal għal kompetizzjoni qawwija bejn il-primer u reverse transcriptase u l-mudell, li jirriżulta f'serje ta 'problemi bħal E baxx u ripetibbiltà fqira.

X'tagħmel?Żid biss it-temperatura ta 'l-ittemprar kemm jista' jkun.

Bosta manifatturi tar-reaġenti qed itejbu t-traskriptase inversa tagħhom permezz tal-inġinerija ġenetika.Xi wħud iżidu t-temperatura tar-reazzjoni, bħal Jifan u Aidelai, u xi wħud ineħħu l-grupp attiv tal-enzima RNase H biex itejbu l-affinità bejn l-enzima u l-mudell RNA.Affinità għolja tista 'tgħafas b'mod kompetittiv l-istruttura sekondarja u taqra mingħajr xkiel, u ttejjeb ukoll ħafna l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa.
Punt ewlieni: Traskrizzjoni inversa hija aktar importanti biex issegwi l-konsistenza tal-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa (l-enzimi għandhom mhux biss ikunu effiċjenti iżda wkoll stabbli), aktar milli l-ammont ta 'kampjun mgħobbi, jekk ma jkunx PCR kwantitattiv fluworexxenti partikolarment fuq skala kbira, ma jkunx possibbli għal kollox.cDNAs multipli.
Diversi manifatturi għamlu wkoll xi sforzi fl-insegwiment tal-konsistenza.Pereżempju, il-biċċa l-kbira tal-kumpaniji issa ppakkjaw it-traskrizzjoni inversa bħala kit standard għall-bejgħ, li hija għażla tajba.
Pereżempju, il-kits tas-Serje RT Easy ta' Foregene:

RT Easy I (Premix prinċipali għall-kitt tas-sinteżi tal-cDNA tal-ewwel linja)

MIQE (5) – informazzjoni dwar il-ġene fil-mira

Il-figura ta 'hawn fuq tispjega
1. Jekk dan il-ġene huwiex effettiv għal esperimenti ripetuti ġeneralment jista 'jiġi vverifikat b'esperimenti ripetuti.
2. Gene ID, taf.
3. It-tul tal-ġeni, it-tul totali tal-ġene fil-mira huwa definittivament l-ebda problema.Meta tfassal primers, kun żgur li t-tul tal-amplicon ikun bejn 80-200bp biex tiżgura effiċjenza aħjar tal-amplifikazzjoni.
4. Informazzjoni ta 'tqabbil ta' sekwenza Blast, il-ġene fil-mira jeħtieġ li jitqabbel fil-bank tal-ġeni biex jipprevjeni amplifikazzjoni mhux speċifika.
5. Preżenza ta 'psewdoġeni.Psewdoġene huwa sekwenza tad-DNA simili għal ġene normali iżda jitlef il-funzjoni normali tiegħu.Ħafna drabi teżisti fil-familja multi-ġene tal-ewkarjoti.Normalment huwa rappreżentat minn ψ.Hija kopja tad-DNA ġenomika mhux funzjonali fil-ġenoma li hija simili ħafna għas-sekwenza tal-ġene tal-kodifikazzjoni., ġeneralment mhumiex traskritti, u m'għandhom l-ebda tifsira fiżjoloġika ċara.
6. Pożizzjoni tal-primers relattiva għall-esons u l-introni.Fis-snin bikrija, meta solvejna l-problema tal-kontaminazzjoni tad-DNA, ħafna drabi tajna attenzjoni għall-pożizzjonijiet ta 'primers, exons, u introns, u ġeneralment ikkunsidrajna li nfasslu primers madwar introns biex tiġi evitata l-amplifikazzjoni tad-DNA.Jekk jogħġbok ara l-figura hawn taħt: iswed jirrappreżenta introns, blu varji jirrappreżentaw exons, roża jirrappreżenta primers komuni, u aħmar jgħajjat ​​jirrappreżenta primers li jkopru l-intron.

Skematiku, qatt minnu
X'pjan perfett jidher dan, iżda fil-fatt, fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, il-primers trans-intron mhumiex daqshekk maġiċi kif immaġina, u se jikkawżaw ukoll amplifikazzjoni mhux speċifika.Allura l-aħjar mod biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni tad-DNA huwa li tneħħi kompletament id-DNA.
7. Tbassir tal-konformazzjoni.Uża dan l-eżempju mill-ġdid, uża l-għodda onlajn mFold biex tiddetermina l-istruttura sekondarja tal-framment fil-mira f'temperatura speċifika u konċentrazzjoni tal-melħ.

Struttura sekondarja ta 'RNA f'temperaturi differenti
L-istruttura sekondarja hija t-tqabbil kumplimentari tal-mudell innifsu, li jwassal għal kompetizzjoni qawwija bejn il-primer u t-tqabbil tal-mudelli, u ċ-ċansijiet ta 'rbit tal-primer huma inqas, li jirriżultaw f'serje ta' problemi bħal E baxx u ripetibbiltà fqira.Permezz tat-tbassir tas-softwer, jekk ma jkunx hemm problema ta 'struttura sekondarja, dan ikun kbir.Jekk ikun hemm, l-artiklu ta 'segwitu tagħna se jiddiskuti speċifikament kif issolvi din il-problema.

MIQE (6) —qPCR Oligonucleotides

Għal PCR kwantitattiv fluworexxenti, l-ewwel ħaġa li tissielet magħha kuljum hija l-estrazzjoni tal-RNA, u t-tieni ħaġa tista 'tkun id-disinn tal-primer.
L-ewwelnett, għadna niċċekkjaw ir-regoli dwar id-disinn tal-primer skont il-lista ta 'kontroll MIQE.Huwa tant sempliċi li l-iskumbags jistgħu tidħaq, u nistgħu nispiċċawha f'sentenza waħda: sib is-sekwenza u l-pożizzjoni tas-sonda tal-primer u l-metodu ta 'modifika.Għall-metodu ta 'purifikazzjoni tal-primer, is-sinteżi tal-primer hija tant irħisa fil-preżent, qPCR huwa denju ta' PAGE u metodi ta 'purifikazzjoni 'l fuq, u l-informazzjoni tal-istrument ta' sinteżi mhix importanti.Ħafna nies ilhom jagħmlu primers għal għexieren ta 'snin u ma jafux li s-sintetizzatur huwa ABI3900.
Rigward il-prinċipji tad-disinn primer, m'għandekx għalfejn timmemorizzahom bir-rote, minħabba li l-biċċa l-kbira tas-softwer tad-disinn tal-primer jew għodod onlajn jistgħu jieħdu ħsieb dawn il-problemi (għodda online rakkomandata primer3.ut.ee/), u 99.999% tad-disinn tal-primer ma jsirx manwalment Ħares, l-awtur kultant jiddisinja mijiet ta 'primers kuljum, jekk taqra wieħed wieħed, se jsir cross-eyed.
Iċċekkja biss il-punti li ġejjin wara li l-primers ikunu ddisinjati:
1. Primers tad-disinn qrib it-tarf 3′: Fil-każ li jintużaw primers oligo dT għas-sintesi tal-ewwel linja cDNA, meta wieħed iqis l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa u l-integrità tal-RNA, il-primers iddisinjati jeħtieġ li jkunu ddisinjati qrib it-tarf 3′ biex itejbu l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni .Uża stampa biex tispjega kif ġej (m'hemm l-ebda mod biex tifhem dan):

Għaliex għandhom jiġu ddisinjati primers qrib it-tarf 3′, m'għandux ikun veru
2. Valur TM: Il-valur Tm huwa f'55-65 ° C (minħabba li l-attività exonuclease hija l-ogħla f'60 ° C), u l-kontenut GC huwa f'40% -60%.
3. BLAST: Sabiex tiġi evitata amplifikazzjoni mhux speċifika tal-ġenoma, Blast għandu jintuża għal verifika supplimentari.

MIQE(7)—proċess qPCR

1. kit qPCR
Skont ir-rekwiżiti tal-MIQE, irridu niddeskrivu b'mod ċar il-kundizzjonijiet kompluti ta 'reazzjoni fl-artikolu, inkluża l-konfigurazzjoni tas-sistema ta' reazzjoni PCR, liema kit jintuża, min huwa l-manifattur, kemm hi kbira s-sistema ta 'reazzjoni, kemm jekk jintuża l-metodu taż-żebgħa jew il-metodu tas-sonda, issettjar tal-programm PCR.Is-sewwieqa veterani żgur ser isibu li sakemm jintgħażel il-kit, l-informazzjoni ta 'hawn fuq hija bażikament determinata.
Fil-preżent, il-manifattura u l-produzzjoni ta 'kits PCR kwantitattivi fluworexxenti hija teknoloġija matura ħafna.Sakemm ma tagħżel manifatturi estremament ħżiena, il-probabbiltà ta 'problemi mhix għolja, iżda xorta rridu naqsmu miegħek ftit punti:
Enżima Taq li tibda sħuna:L-aktar parti importanti tal-PCR hija l-enzima Taq hot-start.L-enzimi hot-start fis-suq huma ġeneralment maqsuma f'żewġ tipi, waħda hija enzima hot-start modifikata kimikament (tista 'timmaġinaha bħala inkorporazzjoni tal-paraffin), u l-oħra hija Hija enzima hot-start għall-modifika tal-antikorp (irbit antiġen-antikorp).Il-modifika kimika hija mod bikri ta 'enzimi li jibdew bis-sħana.Meta tintlaħaq ċerta temperatura, l-enzima se tirrilaxxa l-attività tagħha.L-enzima hot-start modifikata bl-antikorpi tuża metodi bijoloġiċi biex timblokka l-attività tal-enzima.Meta tintlaħaq ċerta temperatura, l-antikorp jiġi żnaturat u inattivat bħala proteina, u l-attività ta 'l-enzima tidħol fis-seħħ.

Madankollu, x'inhu l-użu ta 'dan?Dan huwa l-każ, l-attività ta 'rilaxx ta' enzimi modifikati b'antikorpi hija aktar mgħaġġla minn dik ta 'enzimi modifikati kimikament, għalhekk f'termini ta' sensittività, enzimi modifikati b'antikorpi għandhom vantaġġ żgħir, sabiex bażikament ma jkun hemm l-ebda enzimi modifikati kimikament fil-kits fis-suq.Jekk ikun hemm, allura din it-teknoloġija tal-manifattur għadha mwaħħla fl-era tal-millennju.
Konċentrazzjoni tal-jone tal-manjeżju:Il-konċentrazzjoni tal-jone tal-manjeżju hija importanti ħafna fir-reazzjoni tal-PCR.Konċentrazzjoni xierqa tal-jone tal-manjeżju tista 'tippromwovi r-rilaxx tal-attività tal-enzima Taq.Jekk il-konċentrazzjoni tkun baxxa wisq, l-attività tal-enzima titnaqqas b'mod sinifikanti;jekk il-konċentrazzjoni hija għolja wisq, l-amplifikazzjoni mhux speċifika kkatalizzata bl-enżimi tissaħħaħ.Il-konċentrazzjoni ta 'jonji tal-manjeżju se taffettwa wkoll l-ittemprar ta' primers, it-temperatura tat-tidwib tal-mudell u l-prodotti tal-PCR, u b'hekk taffettwa r-rendiment ta 'frammenti amplifikati.Il-konċentrazzjoni tal-joni tal-manjeżju hija ġeneralment ikkontrollata f'25mM.Naturalment, għal kit tajjeb, il-konċentrazzjoni ta 'jonji tal-manjeżju għandha tkun ikkontrollata tajjeb.Xi negozjanti jżidu aġent kelanti tal-jone tal-manjeżju mar-reaġent, li jista 'jikseb l-effett ta' aġġustament awtomatiku tal-konċentrazzjoni tal-jone tal-manjeżju.
Konċentrazzjoni taż-żebgħa fluworexxenti:Żebgħa fluworexxenti, li hija s-SYBR Green li normalment nużaw, prinċipalment tiġġenera fluworexxenza billi torbot mal-kanal minuri tad-DNA bi stranded doppju, minħabba li l-irbit taż-żebgħa mad-DNA bi stranded doppju mhuwiex speċifiku, jiġifieri Sakemm id-DNA bi stranded doppju jiġi kkombinat magħha, jista 'jseħħ fluworexxenza, għalhekk primer-dimers u se jgħaqqdu sinjali ta' l-isfond fis-sistema tad-DNA f'mudelli ta 'DNA.
PS: Minħabba l-proprjetajiet sensittivi għad-dawl tiegħu, il-prodotti fis-suq huma ġeneralment ippakkjati f'tubi ċentrifugi kannella opaki (kif muri fl-istampa hawn taħt).Madankollu, dan se jiltaqa 'ma' problema.Huwa diffiċli li wieħed jara jekk il-likwidu jinġibedx meta jittieħed il-kampjun.F'dan ir-rigward, Qingke huwa tabilħaqq l-aktar faċli għall-utent (kif muri fl-istampa hawn taħt), u t-tubu trasparenti huwa ppakkjat f'borża tal-landa opaka.Imbagħad poġġiha f'borża tal-landa, b'kont meħud tal-konvenjenza li tevita d-dawl u t-teħid ta 'kampjuni.Trid tagħżel in-numru tal-prodott it-tajjeb.TSE204 hija eżistenza super kost-effettiva, li ġġiegħli nixtieq niżra 'ħaxix.

Il-konċentrazzjoni taż-żebgħa fluworexxenti hija wkoll importanti ħafna.Jekk il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq, il-kurva ta 'amplifikazzjoni mhux se titla' fl-istadju aktar tard u mhix perfetta;jekk il-konċentrazzjoni tkun għolja wisq, tikkawża interferenza tal-istorbju.Peress li l-PCR kwantitattiv fluworexxenti jiddependi prinċipalment fuq il-valur CT, jekk il-konċentrazzjoni taż-żebgħa fluworexxenti ma tkunx aġġustata kif suppost, il-punt baxx huwa aħjar mill-punt għoli.Naturalment, il-konċentrazzjoni xierqa taż-żebgħa hija l-aħjar.

ROX: Iż-żebgħat ROX jintużaw biex jikkoreġu żbalji tas-sinjali tal-fluworexxenza sew għal tajjeb.Xi manifatturi tal-istrumenti jeħtieġu kalibrazzjoni, filwaqt li oħrajn le.Pereżempju, l-użu tal-istrument ta 'amplifikazzjoni tal-PCR Real Time ta' Thermo Fisher Scientific normalment jeħtieġ kalibrazzjoni, inklużi 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, eċċ. L-istruzzjonijiet tal-kit ġenerali se jiddeskrivuha.
QPCR Mix ta 'Foregene fih ukoll żebgħa ROX, li hija konvenjenti għall-użu f'diversi mudelli.

Real Time PCR Kit-Taqman

Trattament ta 'bonds ta' idroġenu dgħajjef: It-trattament ta 'bonds ta' idroġenu dgħajfa huwa kwistjoni relattivament teknika.Xejn ma qara l-manwali ta 'ħafna kits, iżda ħadd minnhom ma semma dan is-suġġett.Fil-fatt, huwa tant importanti.Il-kombinazzjoni ta 'bażijiet tiddependi prinċipalment fuq is-saħħa tal-bonds tal-idroġenu.Rabtiet qawwija ta 'l-idroġenu huma amplifikazzjoni normali, u bonds ta' idroġenu dgħajfa jwasslu għal amplifikazzjoni mhux speċifika.Jekk ir-rabtiet dgħajfa tal-idroġenu ma jistgħux jiġu eliminati sew, amplifikazzjoni mhux speċifika ma tistax tiġi evitata.Fl-ambitu tal-awtur, ftit kumpaniji biss innotaw din il-problema.Meta tixtri l-kit, tista 'tirreferi għal jekk ikkunsidrajtx soluzzjoni f'dan ir-rigward għall-kit li trid tagħżel.

Volum ta' reazzjoni: Is-sistema 20-50ul tintuża aktar komunement, u volumi iżgħar x'aktarx li jikkawżaw żbalji.B'mod ġenerali, l-istruzzjonijiet tal-kit se jirrakkomandaw l-użu ta 'volumi ta' reazzjoni PCR.M'għandekx tkun intelliġenti u tuża volumi iżgħar biex tiffranka l-ispejjeż.l-għan ta.Il-volum rakkomandat min-negozjanti fil-fatt ġie ttestjat, u jista 'jkun li ma jistgħux isolvu l-problema ta' żbalji kkawżati minn volumi żgħar.
2. Il-manifattur u n-numru ta 'l-artikolu tal-pjanċa tat-tubu
Kulħadd jaf il-prinċipju tal-PCR kwantitattiv fluworexxenti.Il-ġbir tal-fluworexxenza jitwettaq prinċipalment permezz ta 'tappijiet tat-tubi tal-PCR.Meta tagħżel konsumabbli tal-PCR, oqgħod attent għal żewġ punti: trasmissjoni tajba tad-dawl u adattata għall-istrument.B'mod ġenerali, il-bordijiet u t-tubi tal-marki mainstream huma tajbin, iżda trid tagħżel bir-reqqa f'termini ta 'adattament, inkella ma tkunx tista' tuża l-istrument.

4. Għarfien tal-ogħla livell

MIQE (8)—validazzjoni tal-qPCR
Din hija l-ogħla prijorità tal-qPCR!Allura ħafna eroj waqgħu fir-ramel hawn.Ovvjament, huwa possibbli wkoll li int xortik tajba u l-ġeni li studjajt huma sempliċi, u għalhekk tgħaddi f'wiċċ l-ilma mill-għar tas-silġ tul ir-riħ.L-informazzjoni tal-verifika tal-qPCR hija maħsuba biex tittestja l-affidabbiltà tad-dejta.Aħna jelenkaw l-informazzjoni ta' verifika meħtieġa kif ġej:

1.Test ta 'speċifiċità
L-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni tal-ġeni fil-mira hija ttestjata billi jiġi vverifikat jekk l-istampa tal-elettroforeżi hijiex faxxa waħda;verifika tas-sekwenzjar;kurva tat-tidwib biex tara jekk il-mappa tal-quċċata hijiex waħda;verifika tad-diġestjoni tal-enżimi u metodi oħra.
Hawnhekk, aħna niffukaw fuq tAnaliżi ta 'amplifikazzjoni mhux speċifika bl-użu tal-metodu ta' kurvi tat-tidwib.B'mod ġenerali, meta niddisinjaw primers, id-daqs tal-framment tal-prodott huwa meħtieġ li jkun fil-medda ta '80-200bp, li jagħmel it-temperatura tat-tidwib tal-prodott PCR 80-85 °C firxa.Għalhekk, jekk ikun hemm qċaċet mixxellanji, għandu jkun hemm prodotti oħra ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi;jekk il-quċċata tidher taħt it-80 ° C, ġeneralment jitqies li jkun primer dimer;jekk il-quċċata tidher 'il fuq minn 85°C, ġeneralment titqies bħala kontaminazzjoni tad-DNA jew aktar amplifikazzjoni mhux speċifika ta' frammenti kbar.
Nota: Xi drabi jkun hemm biss quċċata waħda f'80 ° C.F'dan iż-żmien, dan il-kunċett għandu jiġi rispettat.Huwa probabbli li r-riżultati tal-amplifikazzjoni huma kollha dimeri primer.

Kurva tat-tidwib normali (quċċata waħda mingħajr amplifikazzjoni mhux speċifika)

Kurva tat-tidwib problematika (amplifikazzjoni mhux speċifika ta' qċaċet falzi)
【Analiżi tal-każ】

Hemm quċċata ewlenija, iżda d-dimer tal-primer huwa serju
Il-kurva tat-tidwib single-peak fil-figura hawn taħt tista 'faċilment tqarraq bl-għajnejn tiegħek, billi taħseb li huwa esperiment perfett, iżda r-riżultat huwa kompletament żbaljat.F'dan iż-żmien, irridu nħarsu lejn it-temperatura tat-tidwib.L-ogħla temperatura hija taħt it-80 ° C, li hija kompletament primer-dimer.

L-ebda framment fil-mira, id-dimeri tal-primer kollha
Hawnhekk, ħu ma jistax jieqaf.L-istampa t'hawn taħt hija ritratt meħud b'mowbajl mibgħut lili minn skumbag.Ir-reaġenti li uża huma kollha marki użati b'mod komuni fl-industrija.Huwa nbidel minn marka T-prefiss għal marka oħra T-prefiss.Naħseb li inti diġà guess it.L-iskumbag għajjatli: “Ir-reaġent użat fl-ewwel stampa huwa tajjeb wisq, u l-quċċata hija waħda.Aktar tard, wara li tuża r-reaġent li rrakkomandajt, issir bħat-tieni stampa, b'qċaċet imħallta.Inti għamiltni miserable.“
Separa ż-żewġ graffs.L-ewwel daqqa t'għajn, wieħed għandu quċċata waħda, u l-oħra għandha quċċata doppja.Nonsense, quċċata waħda hija naturalment multa.Huwa veru?
Agħar minn Dou E, jekk inpoġġi ż-żewġ stampi fl-istampa hawn taħt, tifhem immedjatament.Fil-fatt, aħna faċilment paralizzati minn dan it-tip ta 'stampa.Wara analiżi bir-reqqa, sibna li: il-quċċata tal-ewwel figura hija f'75 ° C, li hija kompletament primer dimer;il-quċċata tat-tieni figura tidher f'75°C u 82°C, mill-inqas hemm Il-prodott jidher.

Stampi ta' feedback mill-istudenti
Allura l-problema fundamentali mhix il-problema tar-reaġenti, iżda l-problema tad-disinn tal-primer.Fl-istess ħin, jipprova wkoll li xi marki kbar mhumiex ta 'kwalità tal-ħadid, u jipprova wkoll dak li qal ħu qabel: Mhuwiex il-marka tar-reaġent li tappoġġja l-artiklu tiegħek.Huwa l-artiklu tiegħek li sostna l-marka tar-reaġenti.Immaġina, jekk l-iskumbat ma biddilx ir-reaġenti, id-dejta ħażina tintbagħat lill-ġurnal, u dak li jiġri jkun traġedja.
2. Valur Ct tal-kontroll vojt
Tispjegax, jekk il-kontroll vojt għandu valur Ct, mhux tniġġis?Madankollu, xorta trid tifhem liema kontroll vojt għandu valur Ct.Jekk huwa NTC, dan ifisser li hemm DNA barrani bħal kontaminazzjoni tar-reaġent.Jekk huwa NRT, dan ifisser li l-RNA estratt għandu kontaminazzjoni tad-DNA.
3. Kurva standard
Inkluża l-inklinazzjoni u l-formula tal-kalkolu, l-effiċjenza tal-PCR tista 'tiġi kkalkulata permezz tal-formula.Esperiment perfett jeħtieġ li l-inklinazzjoni tal-kurva standard toqrob lejn 3.32, u R² toqrob lejn 0.9999.
4. Firxa dinamika lineari
Il-firxa dinamika tar-reazzjoni hija lineari.Skont il-mudell użat biex jiġġenera l-kurva standard, il-firxa dinamika għandha tinkludi mill-inqas 5 gradjenti ta 'konċentrazzjoni, u tagħti attenzjoni għall-bidla tal-valuri Ct fi gradjenti ta' konċentrazzjoni għolja u gradjenti ta 'konċentrazzjoni baxxa.
5. Eżattezza tas-sejbien
Bidliet fir-riżultati tal-qPCR, jiġifieri ripetibbiltà fqira, jiġifieri preċiżjoni fqira, huma kkawżati minn ħafna fatturi, inklużi temperatura, konċentrazzjoni u tħaddim.Il-preċiżjoni tal-qPCR ġeneralment issir inqas kontrollabbli hekk kif in-numru tal-kopji jonqos.Idealment fi ħdan varjazzjoni sperimentali, din il-varjazzjoni teknika għandha tkun distinta mill-varjazzjoni bijoloġika, u r-repliki bijoloġiċi jistgħu jindirizzaw direttament id-differenzi statistiċi fir-riżultati tal-qPCR bejn gruppi jew trattamenti.B'mod partikolari għal assaġġi dijanjostiċi, trid tiġi rrappurtata l-aħjar preċiżjoni inter-assaġġi (ripetibbiltà) bejn is-siti u l-operaturi.
6. Effiċjenza tas-sejbien u LOD (f'qPCR multiplex)
LOD hija l-inqas konċentrazzjoni ta' 95% tal-kampjuni pożittivi misjuba.Fi kliem ieħor, il-konċentrazzjoni ta 'LOD li tinsab f'sett ta' repliki tal-ġeni fil-mira m'għandhiex taqbeż il-5% tar-reazzjonijiet falluti.Meta tagħmel analiżi qPCR multiplex, speċjalment għal sejbien simultanju ta 'mutazzjonijiet ta' punt jew polimorfiżmi, qPCR multiplex jeħtieġ li jipprovdi evidenza li l-eżattezza ta 'frammenti ta' mira multipli mhix kompromessa fl-istess tubu, skoperta multipla u skoperta ta 'tubu wieħed L-effiċjenza u l-LOD għandhom ikunu l-istess.Speċjalment meta ġeni fil-mira ta 'konċentrazzjoni għolja u ġeni fil-mira ta' konċentrazzjoni baxxa huma simultanjament amplifikati, din il-problema għandha tingħata attenzjoni.
Problemi u soluzzjonijietB'mod ġenerali, il-problemi li spiss jiltaqgħu magħhom fid-debugging tal-qPCR jiffokaw fuq l-aspetti li ġejjin:
·amplifikazzjoni mhux speċifika
· Għażla diffiċli tal-konċentrazzjoni tal-primer u problemi bil-primer-dimers
·It-temperatura ta 'l-ittemprar mhix preċiża
·L-istruttura sekondarja taffettwa l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni
amplifikazzjoni mhux speċifika
amplifikazzjoni mhux speċifikaiseħħ , ġeneralment jitqies jekk id-disinn tal-primer huwiex adattat, imma jekk m'intix bil-għaġla biex tibdel il-primers, tista 'tipprova l-ewwel il-metodi li ġejjin (il-prinċipju huwa wkoll mehmuż):
·Iżżid it-temperatura ta 'l-ittemprar - ipprova tagħmel bonds ta' idroġenu dgħajfa li ma jistgħux iżommu;
· Tqassar il-ħin ta 'l-ittemprar u t-titwil - tnaqqas iċ-ċans ta' bonds ta 'idroġenu dgħajfa;
·Naqqas il-konċentrazzjoni tal-primer - tnaqqas iċ-ċans ta 'rbit ta' primers żejda u reġjuni mhux fil-mira;
Effiċjenza baxxa ta 'amplifikazzjoni
Is-sitwazzjoni opposta għal amplifikazzjoni mhux speċifika - effiċjenza ta 'amplifikazzjoni baxxa, u l-miżuri biex jittrattaw effiċjenza ta' amplifikazzjoni baxxa huma eżatt l-oppost:
·Ttawwal il-ħin ta 'ttemprar u titwil;
·Bidla għal PCR fi tliet stadji u tnaqqas it-temperatura ta 'l-ittemprar;
·Iżżid il-konċentrazzjoni tal-primer;
Ps: Ħafna studenti gradwati mwielda fis-snin 90 mhumiex lesti li jistudjaw kif jiddebugjaw esperimenti, u jittamaw li l-kit jista 'jsolvi kompletament il-problema (jekk trid tmur għand kumpanija tar-reaġenti biex tagħmel riċerka u żvilupp wara l-gradwazzjoni), fil-fatt, il-manifatturi tar-reaġenti jaħsbu wkoll b'dan il-mod, nittama li huwa iqarqu Jista' jintuża meta ġġibu, għalhekk il-manifatturi tar-reaġenti nqattgħu l-lott ta 'sforz li ssolvi l-problema ta' sforz mhux speċifiku. fatturi ta 'assorbiment ta' bonds.Biex issolvi faċilment il-problema, l-iblah xorta jridu jaqraw l-introduzzjoni tal-kumpanija tar-reaġent biex tara jekk hemmx fattur li jassorbi bonds dgħajfa tal-idroġenu.
Għażla diffiċli tal-konċentrazzjoni tal-primer u problemi bil-primer-dimers
Metodu 1: B'mod ġenerali, l-istruzzjonijiet tal-kit għall-qPCR għandhom sistemi rakkomandati u konċentrazzjonijiet tal-primer rakkomandati.
Metodu 2: Debugging billi tissettja l-gradjent tal-konċentrazzjoni tal-primer.L-istampa hawn taħt hija misruqa minn kumpanija biex turi.Il-figura hawn taħt turi r-riżultati kwantitattivi tal-fluworexxenza magħmula bi tliet gradjenti ta 'konċentrazzjoni ta' primer (100nM, 250nM, 500nM) u erba 'gradjenti ta' konċentrazzjoni ta 'mudell (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Il-valur Ct tar-riżultati sperimentali huwa mpinġi kif ġej:

Għażla tal-Konċentrazzjoni tal-Primer Agħlaq kull konċentrazzjoni tal-Primer f'linja kif ġej:

L-għażla tal-konċentrazzjoni tal-primer hija ovvja, ir-relazzjoni lineari tal-konċentrazzjoni tal-primer ta '100nM u 250nM hija aħjar, u r-relazzjoni lineari tal-konċentrazzjoni tal-primer ta' 500nM hija relattivament fqira.F'100nM u 250nM, il-valur Ct ta '250nM huwa relattivament żgħir, għalhekk il-konċentrazzjoni tal-primer ottimali hija 250nM.Ġeneralment primer-dimers severi jistgħu jidhru fil-kurva tat-tidwib.X'jiġri jekk il-primers iddisinjati ma jistgħux jevitaw primer-dimers?
Metodu 3: Naqqas l-ammont ta 'primers u żid it-temperatura ta' l-ittemprar (m'hemmx għalfejn tispjega).
Il-valur empiriku tat-temperatura tal-ittemprar huwa 60°C.Jekk m'intix ċert, kif tagħżel temperatura ta 'ttemprar aktar adattata?It-tweġiba hija l-istess bħall-għażla tal-konċentrazzjoni tal-primer -test tal-gradjent.Ħu stampa mill-kumpanija Bio-rad biex turi l-problema.Għall-amplifikazzjoni ta 'ċertu framment fil-mira, issettja tmien gradjenti ta' temperatura, kull waħda bi tliet repetizzjonijiet, u l-kurva ta 'amplifikazzjoni miksuba hija kif ġej:

għażla tat-temperatura tal-ittemprar:
·70°C, 69°C-Bażikament, il-primers ma jistgħux jiġu kkombinati, għalhekk m'hemm l-ebda amplifikazzjoni.
·67.3 ° C - Hemm ammont żgħir ta 'amplifikazzjoni fil-bidu, u l-valur Ct huwa relattivament kbir.
·64.5°C ——Il-valur Ct jonqos.
·F'60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, u 55.0°C, il-valuri Ct bażikament kellhom it-tendenza li jkunu stabbli, iżda l-valuri finali tal-fluworexxenza kienu differenti.
Kif tagħżel?Prinċipju: L-ewwel prinċipju huwa l-ogħla valur Ct.Għall-istess valur Ct, agħżel temperatura ogħla ta 'ttemprar biex tevita dimerizzazzjoni u amplifikazzjoni mhux speċifika.Għalkemm hemm valur ogħla ta 'fluworexxenza f'55 ° C, jista' jkun hemm dimeri jew amplifikazzjoni mhux speċifika fiha.
Imma jekk int intelliġenti daqsek, żgur ser taħseb: Loġikament, jekk ir-reazzjoni tal-PCR hija speċifika ħafna, sakemm il-konċentrazzjoni tal-primer taqbeż ir-rekwiżit minimu, il-punti għoljin u baxxi m'għandhomx ikollhom effett, bħad-żebgħa fluworexxenti u dNTPs.Tabilħaqq, sakemm it-temperatura ta 'l-ittemprar tkun ottimizzata kif suppost, l-effett tal-konċentrazzjoni tal-primer fuq il-valur Ct naturalment jiġi minimizzat.

It-temperatura ta 'l-ittemprar hija ottimizzata kif suppost, u l-effett tal-konċentrazzjoni tal-primer fuq CT se jiġi minimizzat
L-istruttura sekondarja taffettwa l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni
Ejja nieħdu l-istampa minn Bio-rad biex turi l-problema.Jiddisinja wkoll gradjent tat-temperatura biex jamplifika ġene bi struttura sekondarja.

Struttura sekondarja toħroġ
Wieħed jista 'jara li hekk kif il-gradjent tat-temperatura jonqos, il-prodotti jibdew jidhru u l-valur Ct jimxi 'l quddiem, jilħaq il-valur minimu f'60.7 ° C, u mbagħad hekk kif il-gradjent tat-temperatura jonqos, il-valur Ct isir akbar.Bil-maqlub, hekk kif it-temperatura tiżdied, l-istruttura sekondarja tiftaħ u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tiżdied.Wara li tilħaq ċerta temperatura, iż-żieda fit-temperatura ma tistax ittejjeb l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni.Minħabba li l-primers ma jistgħux jiġu kkombinati b'mod stabbli f'dan il-ħin.Għalhekk,Fittex it-temperatura bl-inqas valur Ct, li hija l-aħjar temperatura għall-amplifikazzjoni tal-mudell tal-istruttura sekondarja!Naturalment, iblah intelliġenti għandhom ikunu jafu li jekk ma jkunx meħtieġ, huwa aħjar li tbiddel il-primers u tevita r-reġjun tal-istruttura sekondarja.
5. Livell ta' applikazzjoni
MIQE—Analiżi tad-Dejta

L-analiżi tad-dejta hija mogħtija prinċipalment mill-istrument PCR kwantitattiv fluworexxenti.Fl-artikolu preċedenti, sar ħafna xogħol ta 'analiżi tad-dejta, bħall-kontroll vojt, li ġie spjegat fid-disinn tal-esperiment.Il-ġeni ta' referenza interni, in-numri ripetuti, eċċ. ġew iċċarati., Hawnhekk aħna prinċipalment jispjegaw l-applikazzjoni tal-qPCR.
qPCR huwa użat ħafna, u l-verifika sperimentali u d-dijanjosi ta 'aċidu nuklejku huma l-aktar xenarji komunement użati.
kwantifikazzjoni assoluta
Log (konċentrazzjoni inizjali) għandu relazzjoni lineari man-numru ta 'ċikli.Kurva standard tista 'tinġibed minn standard b'numru ta' kopja inizjali magħruf, jiġifieri, ir-relazzjoni lineari tar-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni tista' tinkiseb.Skont il-valur Ct tal-kampjun, il-konċentrazzjoni fil-kampjun tista 'tiġi kkalkulata.L-ammont ta 'mudelli li għandhom jinkludu.

Metodu ta' Kalkolu Kwantitattiv Assolut
Kwantifikazzjoni assoluta għandha tkun ibbażata fuq il-kurva standard.Biex tagħmel kurva standard, huwa meħtieġ standard.Normalment, l-istandard huwa plasmid miksub mill-klonazzjoni tal-ġene fil-mira.Għaliex huwa plasmid?Minħabba li d-DNA tal-plasmid ċirkolari huwa l-aktar stabbli.Iddilwixxi l-prodott standard f'5 sa 6 gradjenti skont il-proporzjon tal-irduppjar (dilwizzjoni ta '10 darbiet), u oqgħod attent għall-uniformità meta tiddilwixxi.Ħalli l-valur Ct jaqa 'bejn 15-30.

Preparazzjoni standard
Fl-istess ħin, il-kampjun li għandu jiġi ttestjat għandu wkoll jiġi dilwit kif xieraq (ftakar il-fattur ta 'dilwizzjoni), u l-valur Ct għandu wkoll jaqa' bejn 15-30.Il-prodott standard + il-kampjun li għandu jiġi ttestjat jitpoġġew fuq il-magna flimkien.Wara l-ġirja, saret kurva standard bis-sustanza standard, u l-kampjuni li għandhom jiġu ttestjati ddaħħlu fil-kurva standard biex tiġi kkalkulata l-konċentrazzjoni.
Il-kwantifikazzjoni tal-HBV tal-virus tal-epatite B hija kwantifikazzjoni assoluta tipika, li tista 'tikkalkula n-numru tal-kopja tal-virus f'1ml ta' demm.
Kalkolu tan-numru tal- kopja
Konċentrazzjoni tal-kampjun li trid tiġi ttestjata (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × fattur ta' dilwizzjoni
Piż molekulari tal-kampjun = numru ta 'bażijiet × 324
In-numru tal-kopja tal-kampjun li jrid jiġi ttestjat (kopji/ul) = il-konċentrazzjoni tal-kampjun li jrid jiġi ttestjat / il-piż molekulari tal-kampjun × 6 × 1014

Metodu ta' kalkolu tan-numru tal-kopja

Dan ta 'hawn fuq huwa l-metodu ta' kalkolu għad-determinazzjoni tal-kwantità.Din hija problema matematika li tista 'tiġi solvuta wara li jiggradwaw mill-iskola sekondarja, u l-problemi matematiċi huma ġeneralment solvuti bil-kompjuters.Jekk ma tifhimx, tista’ tiġi biex tikkomunika.
kwantifikazzjoni relattiva
Kwantifikazzjoni relattiva tintuża prinċipalment fir-riċerka xjentifika.Kemm hemm viruses f'1ml ta 'demm, u huwa virus tad-DNA, dan huwa avveniment relattivament deterministiku: l-ammont ta' demm jista 'jiġi determinat, u l-virus tad-DNA huwa relattivament stabbli.Madankollu, huwa diffiċli għalina li nqabblu n-numru ta 'kopji ta' traskrizzjoni ta 'ċertu ġene f'werqa, minħabba li huwa diffiċli li tiddetermina d-daqs, il-piż u t-tenerezza tal-werqa, l-ammont ta' RNA estratt huwa diffiċli li jiġi ddeterminat, u l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hija wkoll diffiċli biex tiddetermina, jiġifieri, kwalunkwe pass jista 'jagħmel id-dejta sperimentali jkollha bugs u ma tistax tintuża.
Għalhekk, kwantifikazzjoni relattiva għandha tintroduċi element:il-ġene ta' referenza interna.
Fi kliem ieħor, il-kwantifikazzjoni relattiva hija fil-fatt paragun bejn il-ġene fil-mira u l-ġene ta 'referenza interna.Meta mqabbla fl-istess tessut u l-istess ċellula, l-influwenza tad-daqs tal-kampjun, l-ammont ta 'estrazzjoni ta' RNA, l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa, u l-effiċjenza tal-PCR hija relattivament żgħira.Minħabba d-daqs żgħir tal-kampjun, kemm il-ġeni ta 'referenza interni kif ukoll il-ġeni fil-mira tnaqqsu relattivament.Huwa għalhekk li qabel konna nenfasizzaw l-uniformità u l-istabbiltà.
Ġeni ta 'referenza interni huma ġeneralmentġeni tad-dar(ġeni tad-dar), li jirreferu għal klassi ta 'ġeni li huma espressi b'mod stabbli fiċ-ċelloli kollha, u l-prodotti tagħhom huma meħtieġa biex iżommu l-attivitajiet bażiċi tal-ħajja taċ-ċelloli.
Tħawwadx dan il-kunċett.Il-ġeni tad-dar huma termini ta' funzjoni bijoloġika, filwaqt li l-ġeni ta' referenza interni huma termini tekniċi sperimentali.Il-ġeni tal-manutenzjoni tad-dar jeħtieġ li jgħaddu l-validazzjoni qabel ma jkunu jistgħu jintgħażlu bħala ġeni ta' referenza interni.
Pereżempju, għażilna diversi ġeni tad-dar fil-figura ta 'hawn taħt biex nittestjaw il-livelli ta' espressjoni tagħhom f'ċelluli tat-tessuti differenti, u sibna li l-livelli ta 'espressjoni ta' β-2-mikroglobulina kienu pjuttost differenti minn dawk tat-tliet ġeni l-oħra, għalhekk ma setgħux jintużaw bħala ġeni ta 'referenza interna.

Wara li tifhem il-funzjoni ta 'korrezzjoni tal-ġene ta' referenza interna, żewġ algoritmi huma derivati ​​minħabba l-introduzzjoni tal-ġene ta 'referenza interna.
·metodu ta 'kurva standard doppju
·2 – Metodu △△Ct (metodu ta’ tqabbil tal-valur CT)
Jekk inti interessat li tistudja l-ispeċijiet u l-funzjonijiet tal-ġeni, jekk jogħġbok ċedi r-riċerka dwar l-algoritmi u uża formuli direttament, jew uża magni direttament;jekk inti raġel dritta fil-matematika u l-inġinerija, jekk jogħġbok tħossok liberu.
metodu ta 'kurva standard doppja
Ikkwantifika l-ġene fil-mira u l-ġene tad-dar tal-kampjun ta 'kontroll u l-kampjun li għandu jiġi ttestjat permezz tal-kurva standard, u mbagħad ikkalkula l-valur relattiv skond il-formula ta' kalkolu, li hija l-livell ta 'espressjoni relattiva.
Vantaġġi: analiżi sempliċi, ottimizzazzjoni sperimentali relattivament sempliċi
Żvantaġġ: Għal kull ġene, kull rawnd ta 'esperimenti għandu jagħmel kurva standard
Applikazzjoni: Wieħed miż-żewġ metodi kwantitattivi relattivi l-aktar użati u rikonoxxuti fl-istudju tar-regolamentazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni
Il-formula hija kif ġej:

Eżempji huma kif ġej:

Ikkalkula l-ammont relattiv ibbażat fuq ir-riżultat kwantitattiv
2 – Metodu △△Ct (metodu ta' tqabbil tal-valur CT)

Vantaġġi: M'hemmx bżonn li tagħmel kurva standard
Żvantaġġi: Huwa preżunt li l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija qrib il-100%;id-devjazzjoni standard hija < 5%, u l-kurva standard u l-effiċjenza bejn kull amplifikazzjoni huma preżunti li huma konsistenti;l-ottimizzazzjoni tal-kundizzjonijiet sperimentali hija aktar ikkumplikata.
Applikazzjoni: Wieħed miż-żewġ metodi kwantitattivi relattivi l-aktar użati u rikonoxxuti fl-istudju tar-regolamentazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni

Naturalment, l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija ġeneralment impossibbli li tkun perfettament 1. Metodu ta 'korrezzjoni: Jekk nafu li l-ġene fil-mira u l-ġene ta' referenza għandhom l-istess effiċjenza tal-amplifikazzjoni, iżda l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni mhix ugwali għal 1, allura 2－△△Ct jista 'jiġi kkoreġut bħala: (1+E )－△△Ct, per eżempju, jekk l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tiġi kkoreġuta, 95 tista' tiġi kkoreġuta. 1.95－△△Ct
S'issa, il-kontenut dwar il-PCR kwantitattiv fluworexxenti wasal fi tmiemu.