Escherichia Coli O157: Kit ta' Sejbien ta' Aċidu Nuklejku H7 (Metodu ta' Sonda Fluworexxenti PCR/Lijofilizzazzjoni)
Deskrizzjoni tal-Kit:
Cat.Nru.FP103
Jintuża għal skoperta u screening rapidu ta 'E. coli O157:H7 fl-ikel, għalf, kampjuni tal-ilma u kampjuni ambjentali.
Deskrizzjonijiet
Jintuża għalsejbien rapidu u screening ta 'E. coli O157:H7 fl-ikel, għalf, kampjuni ta' ilma u kampjuni ambjentali.
[Prinċipju tal-ittestjar]
Skont il-prinċipju tat-teknoloġija tal-PCR fluworexxenti, primers speċifiċi u sondi Taqman huma ddisinjati għall-ġene speċifiku ta 'Escherichia coli O157: H7, u skoperti minn strument PCR fluworexxenti, sabiex jiġu realizzati l-iskoperta ta' Escherichia coli O157: H7 Sejbien kwalitattiv tad-DNA.
Kontenut tal-Kit
Nota: is-sonda tal-kanal ROX mhix inkluża.
| Componenti | Speċifikazzjoni | Qentità |
| Buffer A | Tubu | 1 |
| Buffer B | Tubu | 1 |
| Kontroll pożittiv | Tubu | 1 |
| Kontroll negattiv | Tubu | 1 |
Użu Mistenni
Jintuża għal sejbien rapidu u screening ta 'E. coli O157:H7 fl-ikel, għalf, kampjuni ta' ilma u kampjuni ambjentali.
Kundizzjonijiet tal-Ħażna U Data ta' Skadenza
Aħżen f'-20℃ fid-dlam u evita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti.
Il-perjodu ta’ validità huwa 12xhur, u d-data tal-produzzjoni tidher fuq l-imballaġġ ta 'barra.
Strumenti U Konsumabbli
Strument tal-PCR kwantitattiv fluworexxenti, pistola tal-pipetta u tips li jaqblu, vortex shaker, mini ċentrifuga.
Użu
1. Ipproċessar tal-Kampjun
1.1 Tip ta 'kampjun: Dan il-kit huwa adattat għal kampjuni ta' ikel, għalf, ilma u kampjuni oħra suspettati li huma kkontaminati minn Escherichia coli O157:H7.Għal prodotti tal-laħam ipproċessati fil-fond, xorb u sustanzi oħra li fihom pigmenti, jeħtieġ li jitlaħlaħ biex jevitaw li jaffettwaw il-ġbir tas-sinjali tal-fluworexxenza.
1.2 Ipproċessar tal-kampjun: Irreferi għal "GB 4789.10-2016 Eżami Mikrobijoloġiku ta 'l-Ikel Standard Nazzjonali ta' Escherichia coli O157: Test H7" għall-preparazzjoni tal-kampjun, kultura ta 'arrikkiment u iżolament ta' Escherichia coli O157: H7.
- Nestrazzjoni ta 'aċidu uklejku
Ħu 20 mL ta 'soluzzjoni ta' arrikkiment f'tubu ċentrifugu ta '1.5 mL, żid 200 μL ta' lisat mikrobjali (kit addizzjonali huwa meħtieġ), vortex għal 30 sekonda, ċentrifuga fil-qosor, u warrab.
Rimarki: L-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku mil-lisat għandha titlesta fi żmien 10 minuti, u ma tistax tinħażen għal żmien twil.
3. Amplifikazzjoni tal-Aċidu Nuklejku
3.1 Ixgħel l-istrument tal-PCR kwantitattiv fluworexxenti għall-użu.
Buffer A u Buffer B mill-kit , dewwebhom sewwa, u ċentrifuga fil-qosor.Żid 18 μL Buffer A u 2 μL Buffer B ma' kull tubu ta' reazzjoni tal-PCR.Imbagħad żid 5 mL kull wieħed mill-kontroll negattiv, l-aċidu nuklejku estratt, u l-kontroll pożittiv fit-tubi tar-reazzjoni tal-PCR, għatti t-tubi, u ċċentrifuga fil-qosor.
3.3 Ittrasferixxi t-tubu ta 'reazzjoni PCR għal magna PCR fluworexxenti, u uża l-proċeduri li ġejjin biex twettaq esperimenti ta' amplifikazzjoni: agħżel 25 mL għas-sistema ta 'reazzjoni, iġbor sinjali ta' fluworexxenza f'60 ° C għal kull ċiklu, u agħżel FAM għall-kanal ta 'skoperta.
| Pass | Programm | Numru ta' ċikli |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (iġbor il-fluworexxenza) |
Gwidi għall-analiżi tal-problemi
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
L-ebda RNA ma jista 'jiġi estratt jew ir-rendiment ta' aċidu nuklejku huwa baxx
Normalment ikun hemm ħafna fatturi li jaffettwaw l-effiċjenza ta 'rkupru, bħal: kontenut ta' RNA tal-kampjun, metodu ta 'tħaddim, volum ta' elużjoni, eċċ.。
Analiżi ta 'kawżi komuni:
1.Banju tas-silġ jew ċentrifugazzjoni b'temperatura baxxa (4 ° C) waqt it-tħaddim.
Suġġeriment: It-tħaddim tat-temperatura tal-kamra (15-25 ° C), qatt banju tas-silġ u ċentrifuga b'temperatura baxxa.
2. Ħażna mhux xierqa tal-kampjuni jew ħażna tal-kampjuni għal żmien twil wisq.
Suġġeriment: Aħżen il-kampjuni f'-80 ° C jew iffriżar f'nitroġenu likwidu, u evita l-użu ripetut ta 'friża u tinħall;ipprova uża kampjuni miġbura friska għall-estrazzjoni tal-RNA.
3.Liżi tal-kampjun insuffiċjenti
Rakkomandazzjoni: Jekk jogħġbok kun żgur li l-kampjun u s-soluzzjoni tax-xogħol (Linear Acrylamide) ġew imħallat sewwa u inkubati għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra (15-25 ° C)
4.L-eluwent ġie miżjud b'mod żbaljat
Rakkomandazzjoni: Kun żgur li ddH2O Ħieles mill-RNase huwa miżjud man-nofs tal-membrana tal-kolonna tal-purifikazzjoni
5.Volum mhux xieraq ta 'etanol anidru fil-Buffer viRW2
Suġġeriment: Jekk jogħġbok segwi l-istruzzjonijiet, żid il-volum korrett ta 'etanol anidru ma' Buffer viRW2 u ħallathom sew qabel tuża l-kit。
6.Użu mhux xieraq tal-kampjun.
Suġġeriment: 200μl ta' kampjun għal kull 500μl ta' Buffer viRL.Volum ta' kampjun eċċessiv jirriżulta f'rata mnaqqsa ta' estrazzjoni ta' RNA.
7.Volum ta 'elużjoni mhux xieraq jew elużjoni mhux kompluta.
Suġġeriment: Il-volum tal-eluwent tal-kolonna tal-purifikazzjoni huwa 30-50μl;jekk l-effett ta' elużjoni ma jkunx sodisfaċenti, huwa rakkomandat li żżid ddH Ħieles minn RNase-msaħħan minn qabel2O u testendi l-ħin tat-tqegħid f'temperatura tal-kamra, bħal 5-10min
8.Kolonna ta 'purifikazzjoni għandha residwu ta' etanol wara t-tlaħliħ fil-Buffer viRW2.
Suġġeriment: Jekk l-etanol għadu jibqa 'wara t-tlaħliħ f'Buffer viRW2 u ċentrifugazzjoni ta' tubu vojt għal 2min, il-kolonna ta 'purifikazzjoni tista' titħalla f'temperatura ambjentali għal 5min wara ċentrifugazzjoni ta 'tubu vojt biex tneħħi kompletament l-etanol li jifdal.
Id-degradazzjoni ta 'molekuli RNA purifikati
Il-kwalità tal-RNA purifikat hija relatata ma 'fatturi bħall-ħażna tal-kampjuni, il-kontaminazzjoni tal-RNase, u l-operat.
Analiżi ta 'kawżi komuni:
1.Il-kampjuni miġbura ma ġewx salvati fil-ħin.
Suġġeriment: Jekk il-kampjun ma jintużax fil-ħin wara l-ġbir, jekk jogħġbok aħżen f'-80 ℃ jew nitroġenu likwidu immedjatament.Għall-estrazzjoni tal-molekuli RNA, ipprova uża kampjuni miġbura friska kull meta jkun possibbli.
2.Kampjuni miġbura kienu iffriżar u tidwib ripetutament.
Suġġeriment: Evita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti (mhux aktar minn darba) waqt il-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni, inkella r-rendiment tal-aċidu nuklejku jonqos.
3.RNase ġie introdott fil-kamra tal-operazzjoni jew ma jintlibsu l-ebda ingwanti li jintremew, maskri, eċċ.
Suġġeriment: L-estrazzjoni tal-esperiment tal-molekuli tal-RNA titwettaq l-aħjar f'kamra separata tal-operazzjoni tal-RNA, u t-tabella sperimentali titnaddaf qabel l-esperiment.Ilbes ingwanti u maskri li jintremew waqt l-esperiment biex tevita d-degradazzjoni tal-RNA kkawżata mill-introduzzjoni tal-RNase.
4.Ir-reaġent huwa kkontaminat minn RNase waqt l-użu.
Suġġeriment: Ibdel b'Viral RNA Isolation Kit ġdid għal esperimenti relatati.
5.Il-kontaminazzjoni RNase tat-tubi taċ-ċentrifugi, il-ponot tal-pipetta, eċċ. Suġġeriment: Kun żgur li t-tubi taċ-ċentrifugi, il-ponot tal-pipetti, u l-pipetti huma kollha Ħieles mill-RNase.
Il-molekuli tal-RNA purifikat affettwaw esperimenti downstream
Il-molekuli RNA ppurifikati mill-kolonna tal-purifikazzjoni se jaffettwaw esperimenti downstream jekk ikun hemm wisq jonji tal-melħ jew proteini, bħal: traskrizzjoni inversa, Northern Blot, eċċ.。
1.Hemm jonji tal-melħ li jifdal fil-molekuli RNA elużi.
Rakkomandazzjoni: Kun żgur li l-volum korrett ta 'etanol anidru ġie miżjud ma' Buffer viRW2, u aħsel il-kolonna ta 'purifikazzjoni darbtejn skond il-veloċità ta' ċentrifugazzjoni korretta fuq l-istruzzjonijiet tat-tħaddim;Imbagħad agħmel ċentrifugazzjoni biex tneħħi l-kontaminazzjoni tal-jonji tal-melħ bl-akbar livell
2.Hemm fadal etanol fil-molekuli RNA elużi
Suġġeriment: ladarba tikkonferma li l-kolonni tal-purifikazzjoni ġew laħlaħ minn Buffer viRW2, wettaq ċentrifugazzjoni ta 'tubu vojt skont il-veloċità ċentrifugali fuq l-istruzzjonijiet tat-tħaddim.Jekk għad fadal etanol, jista 'jitħalla għal 5 minuti f'temperatura tal-kamra wara ċentrifugazzjoni ta' tubu vojt biex jitneħħa l-etanol li jkun fadal bl-akbar livell.
Manwali ta' Istruzzjonijiet:
Manwal ta' Istruzzjoni tal-Kit tal-Iżolament tal-RNA Viral
