Huwa magħruf sew li fid-dogma ċentrali, l-RNA huwa l-medjatur traskrizzjoni bejn id-DNA u l-espressjoni tal-proteini.Meta mqabbel mal-iskoperta tad-DNA, l-iskoperta tal-RNA tista 'tirrifletti b'mod aktar oġġettiv l-espressjoni tal-ġeni fl-organiżmi.Esperimenti li jinvolvu l-RNA jinkludu: qRT-PCR, RNA-Seq, u skoperta tal-ġeni tal-fużjoni, eċċ Ibbażat fuq il-karatteristiċi tal-RNA innifsu (iċ-ċirku taz-zokkor ta 'RNA għandu grupp wieħed ta' hydroxyl ħieles aktar miċ-ċirku taz-zokkor tad-DNA), flimkien ma 'numru kbir ta' RNases fl-ambjent, RNA huwa aktar instabbli u aktar faċli biex jiġi degradat minn DNA.Żibel ġewwa, żibel barra, jekk il-kwalità tal-RNA mhix tajba, allura r-riżultati sperimentali għandhom ma jkunux sodisfaċenti, speċifikament manifestati bħala data mhux preċiża jew ripetibbiltà fqira.Għalhekk, għandha tingħata aktar attenzjoni lill-ipproċessar tal-RNA, u r-rabta tal-kontroll tal-kwalità hija wkoll aktar importanti biex tiżgura l-preċiżjoni u l-eżattezza tad-dejta sperimentali sussegwenti.

Għall-kontroll tal-kwalità tal-RNA, ġeneralment hemm il-metodi komunement użati li ġejjin:

• Spettrofotometrija
• elettroforeżi tal-ġel tal-agarose
• Bioanalizzatur Agilent
• PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali
• Metodu taż-żebgħa fluworexxenti Qubit

01 Spettrofotometrija

L-RNA għandu rabtiet doppji konjugati u għandu quċċata ta 'assorbiment f'wavelength ta' 260nm.Skont il-liġi ta 'Lambert-Beer, nistgħu nikkalkulaw il-konċentrazzjoni tal-RNA mill-quċċata tal-assorbiment f'260nm.Barra minn hekk, nistgħu wkoll nikkalkulaw il-purità tal-RNA skont il-proporzjon tal-qċaċet tal-assorbiment ta '260nm, 280nm u 230nm.280nm u 230nm huma l-qċaċet ta 'assorbiment ta' proteini u molekuli żgħar, rispettivament.Il-proporzjon ta 'A260/A280 u A260/A230 ta' purità RNA kwalifikata għandu jkun akbar minn 2. Jekk ikun inqas minn 2, dan ifisser li hemm kontaminazzjoni ta 'proteini jew molekula żgħira fil-kampjun RNA u jeħtieġ li jerġa' jiġi purifikat.Sorsi ta 'kontaminazzjoni se jaffettwaw esperimenti downstream, bħall-inibizzjoni tal-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tar-reazzjonijiet tal-PCR, li jirriżultaw f'riżultati kwantitattivi mhux preċiżi.Il-purità tal-RNA għandha influwenza kbira fuq riżultati sussegwenti, għalhekk l-ispettrofotometrija hija ġeneralment rabta indispensabbli ta 'kontroll tal-kwalità fl-ewwel pass fl-esperimenti tal-aċidu nuklejku.

Figura 1. Spettru ta 'Assorbiment ta' RNA/DNA tipiku

02 Elettroforeżi tal-ġel tal-agarose

Minbarra l-purità, l-integrità tal-RNA hija wkoll waħda mill-indikaturi importanti biex tiġi ġġudikata l-kwalità tal-RNA.Id-degradazzjoni tal-RNA se twassal għal numru kbir ta 'frammenti qosra fil-kampjun, għalhekk in-numru ta' frammenti tal-RNA li jistgħu jiġu skoperti b'mod effettiv u koperti mis-sekwenza ta 'referenza se jitnaqqas.L-integrità tal-RNA tista 'tiġi ċċekkjata bl-elettroforesi tal-RNA totali fuq ġel agarose ta' 1%.Dan il-metodu jista 'jikkonfigura l-ġel lilek innifsek, jew tuża s-Sistema E-Gel™ prefabbrikata għall-ittestjar tal-integrità.Aktar minn 80% tal-RNA totali huwa RNA ribosomali, li l-maġġoranza tiegħu huwa magħmul minn 28S u 18S rRNA (f'sistemi mammiferi).RNA ta 'kwalità tajba se juri żewġ vireg qawwi ovvji, li huma vireg qawwi 28S u 18S, rispettivament, f'5 Kb u 2 Kb, u l-proporzjon għandu t-tendenza li jkun qrib 2:1.Jekk ikun fi stat mifrux, dan ifisser li l-kampjun ta 'RNA seta' ġie degradat, u huwa rakkomandat li tuża l-metodu deskritt aktar tard biex tittestja aktar il-kwalità ta 'RNA.

Figura 2. Tqabbil ta' RNA degradat (korsija 2) u intatt (korsija 3) fuq elettroforesi tal-ġel tal-agarose

03 Bioanalizzatur Agilent

Minbarra l-metodu ta 'elettroforesi tal-ġel agarose deskritt hawn fuq, li jista' jgħinna nidentifikaw l-integrità tal-RNA b'mod sempliċi u malajr, nistgħu wkoll nużaw il-bijoanalizzatur Agilent biex niddeterminaw l-integrità tal-RNA.Juża taħlita ta 'mikrofluwidi, elettroforeżi kapillari, u fluworexxenza biex tivvaluta l-konċentrazzjoni u l-integrità tal-RNA.Billi juża l-algoritmu inkorporat biex janalizza l-profil tal-kampjun RNA, il-bijoanalizzatur Agilent jista 'jikkalkula valur ta' integrità RNA ta 'referenza, Numru ta' Integrità RNA (minn hawn 'il quddiem imsejjaħ RIN) [1].Iktar ma jkun kbir il-valur tar-RIN, iktar tkun għolja l-integrità tal-RNA (1 huwa estremament degradat, 10 huwa l-aktar komplut).Xi esperimenti li jinvolvu l-RNA jissuġġerixxu li tuża RIN bħala parametru għall-valutazzjoni tal-kwalità.Meta tieħu esperimenti ta 'sekwenzjar ta' produzzjoni għolja (minn hawn 'il quddiem imsejħa NGS) bħala eżempju, il-linji gwida ta 'Oncomine™ Human Immune Repertoire, li jintuża biex jindividwaw riċetturi tal-antiġeni taċ-ċelluli B u T fis-serje tal-pannelli Oncomine ta' Thermo Fisher, jissuġġerixxu li kampjuni b'valuri RIN akbar minn 4, Qari u kloni aktar effettivi jistgħu jitkejlu (Figura 3).Hemm firxiet rakkomandati differenti għal pannelli differenti, u ħafna drabi RIN ogħla jista 'jġib dejta aktar effettiva.

Figura 3, fl-esperimenti Oncomine™ Human Immune Repertoire, kampjuni b'RIN akbar minn 4 jistgħu jiskopru qari aktar effettivi u kloni taċ-ċelluli T.【2】

Madankollu, il-valur RIN għandu wkoll xi limitazzjonijiet.Għalkemm RIN għandu korrelazzjoni għolja mal-kwalità tad-dejta sperimentali tal-NGS, mhuwiex adattat għal kampjuni FFPE.Kampjuni FFPE ġew ittrattati kimikament għal żmien twil, u l-RNA estratt ġeneralment ikollu valur RIN relattivament baxx.Madankollu, dan ma jfissirx li d-dejta effettiva tal-esperiment ma tridx tkun sodisfaċenti.Biex nivvalutaw b'mod preċiż il-kwalità tal-kampjuni FFPE, għandna bżonn nużaw kejl ieħor għajr RIN.Minbarra RIN, Agilent bioanalyzer jista 'wkoll jikkalkula l-valur DV200 bħala parametru ta' evalwazzjoni tal-kwalità tal-RNA.DV200 huwa parametru li jikkalkula l-proporzjon ta 'frammenti akbar minn 200 bp f'kampjun RNA.DV200 huwa indikatur aħjar tal-kwalità tal-kampjun FFPE minn RIN.Għall-RNA estratt mill-FFPE, għandu korrelazzjoni għolja ħafna man-numru ta 'ġeni li jistgħu jiġu skoperti b'mod effettiv u d-diversità tal-ġeni [3].Għalkemm DV200 jista 'jagħmel tajjeb għan-nuqqasijiet fl-iskoperta tal-kwalità tal-FFPE, il-bijoanalizzatur Agilent għadu ma jistax janalizza b'mod komprensiv il-problemi ta' kwalità fil-kampjuni tal-RNA, inkluż jekk hemmx inibituri fil-kampjuni.L-inibituri nfushom jistgħu jaffettwaw l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni ta' esperimenti downstream u jnaqqsu l-ammont ta 'dejta utli.Biex tkun taf jekk hemmx inibitur fil-kampjun, nistgħu nadottaw il-metodu PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali deskritt li jmiss.

04 PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali

Il-metodu PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali jista 'mhux biss jiskopri l-inibituri fil-kampjun, iżda wkoll jirrifletti b'mod preċiż il-kwalità tal-RNA fil-kampjun FFPE.Meta mqabbla mal-analizzaturi bijoloġiċi Agilent, l-istrumenti kwantitattivi ta 'fluworexxenza f'ħin reali huma aktar popolari fil-laboratorji bijoloġiċi ewlenin minħabba l-applikazzjoni usa' tagħhom.Biex tittestja l-kwalità tal-kampjuni tal-RNA, għandna bżonn biss nixtru jew nippreparaw sondi tal-primer għal ġeni ta 'referenza interni, bħal GUSB (Nru tal-Kat Hs00939627).Bl-użu ta 'dan is-sett ta' primers, sondi u standards (RNA totali ta 'konċentrazzjoni magħrufa) biex iwettqu esperimenti kwantitattivi assoluti, il-konċentrazzjoni effettiva tal-framment tal-RNA tista' tiġi kkalkulata bħala l-istandard ta 'evalwazzjoni tal-kwalità tal-RNA (Kwantifikazzjoni tal-RNA Funzjonali (FRQ) fil-qosor).F'test NGS, sibna li l-FRQ tal-kampjuni tal-RNA għandu korrelazzjoni għolja ħafna mal-volum tad-dejta effettiv.Għall-kampjuni kollha akbar minn 0.2ng/uL FRQ, mill-inqas 70% tal-qari jistgħu jkopru b'mod effettiv is-sekwenza ta' referenza (Figura 4).

Figura 4, il-valur FRQ skopert mill-metodu kwantitattiv tal-fluworexxenza għandu korrelazzjoni għolja ħafna (R2> 0.9) mad-dejta effettiva miksuba fl-esperiment NGS.Il-linja ħamra hija l-valur FRQ ugwali għal 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Minbarra li huwa applikabbli għal kampjuni FFPE, il-metodu PCR kwantitattiv f'ħin reali jista 'wkoll jimmonitorja b'mod effettiv l-inibituri fil-kampjuni.Nistgħu nżidu l-kampjun li jiġi skopert fis-sistema ta 'reazzjoni b'Kontroll Pożittiv Intern (IPC) u l-Assaġġ tiegħu, u mbagħad inwettqu kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza biex tikseb il-valur Ct.Jekk il-valur Ct jibqa 'wara l-valur Ct fir-reazzjoni mingħajr kampjun, jindika li l-inibitur huwa preżenti fil-kampjun u jinibixxi l-effiċjenza ta' amplifikazzjoni fir-reazzjoni.

05 Metodu taż-żebgħa fluworexxenti Qubit

Qubit Fluorometer huwa l-aktar apparat żgħir użat komunement għall-konċentrazzjoni ta 'aċidu nuklejku u l-iskoperta tal-purità, li huwa faċli biex topera u jeżisti kważi f'kull laboratorju tal-bijoloġija molekulari.Jikkalkula b'mod preċiż il-konċentrazzjoni ta 'aċidu nuklejku billi tiskopri u żebgħa fluworexxenti li torbot l-aċidu nuklejku (reaġent ta' skoperta Qubit).Qubit għandu sensittività u speċifiċità għolja, u jista 'jikkwantifika b'mod preċiż l-RNA sa konċentrazzjoni pg/µL.Minbarra l-abbiltà magħrufa li tikkwantifika b'mod preċiż il-konċentrazzjoni tal-aċidu nuklejku, l-aħħar mudell ġdid ta 'Thermo Fisher, Qubit 4.0, jista' wkoll jiskopri l-integrità tal-RNA.Is-sistema ta 'skoperta tal-RNA ta' Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) tiskopri l-integrità tal-RNA billi fl-istess ħin tiskopri żewġ żebgħat fluworexxenti speċifiċi.Dawn iż-żewġ żebgħat fluworexxenti jistgħu jorbtu ma 'frammenti kbar u frammenti żgħar ta' RNA, rispettivament.Dawn iż-żewġ żebgħat fluworexxenti jindikaw il-proporzjon ta 'frammenti kbar ta' RNA fil-kampjun, u minn dan jista 'jiġi kkalkulat il-valur IQ (Integrità u Kwalità) li jirrappreżenta l-kwalità tal-RNA.Il-valur IQ huwa applikabbli kemm għal kampjuni FFPE kif ukoll mhux FFPE, u għandu influwenza kbira fuq il-kwalità tas-sekwenzjar sussegwenti.Meta tieħu esperimenti NGS bħala eżempju, fl-esperimenti tat-test RNA-Seq imwettqa fuq il-pjattaforma Ion torrent™, il-biċċa l-kbira tal-kampjuni b'valuri IQ akbar minn 4 kellhom mill-inqas 50% qari effettivi (Figura 5).Meta mqabbel mal-metodi ta 'skoperta msemmija hawn fuq, Qubit IQ Assay mhux biss huwa aktar konvenjenti biex jopera u jieħu inqas ħin (fi żmien ħames minuti), iżda għandu wkoll korrelazzjoni kbira bejn il-valur IQ tal-parametru mkejjel u l-kwalità tad-dejta tal-esperimenti downstream.

Figura 5, hemm korrelazzjoni kbira bejn il-valur Qubit RNA IQ u l-qari mapep ta 'RNA-Seq.【5】

Permezz tal-introduzzjoni ta 'hawn fuq, nemmen li kulħadd għandu fehim suffiċjenti ta' metodi differenti ta 'kontroll tal-kwalità tal-RNA.Fil-prattika, tista 'tagħżelil-metodu korrispondenti skond it-tip tal-kampjun u l-istrumenti eżistenti.Biss billi nikkontrollaw tajjeb il-kwalità tal-RNA nistgħu nevitaw il-falliment ta 'esperimenti sussegwenti kkawżati minn kwalità fqira tal-kampjun, u b'hekk niffrankaw ħin, enerġija u spiża prezzjużi.

Prodotti ta' referenza:

Kit ta' iżolament ta' l-RNA totali ta' l-Annimali

Kit ta' iżolament ta' RNA totali taċ-ċelluli

referenzi

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.L-RIN: numru tal-integrità tal-RNA għall-assenjazzjoni tal-valuri tal-integrità għall-kejl tal-RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. Nru. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volum 170, Awissu, Ħarġa 237192, paġna 237192https://doi.org/10.1093/toxsci/