Sterilizzazzjoni ta 'ponot tal-pipetta u tubi EP, eċċ.
1. Ipprepara 0.1% (elf) DEPC (sustanza tossika ħafna) b'ilma dejonizzat, użah bir-reqqa f'kappa tad-dħaħen, u aħżen f'4 ° C 'il bogħod mid-dawl;
L-ilma DEPC huwa ilma pur trattat b'DEPC u sterilizzat b'temperatura għolja u pressjoni għolja.Ittestjat biex ikun ħieles minn RNase, DNase u proteinase.
2. Poġġi l-ponta tal-pipetta u t-tubu EP f'0.1% DEPC, u żgura li l-ponta tal-pipetta u t-tubu EP jimtlew b'0.1% DEP.
3. Ipproteġi mid-dawl, ħalli toqgħod, matul il-lejl (12-24h)
4. Il-kaxxa li fiha l-ponta u t-tubu EP m'għandhiex għalfejn tixxarrab f'DEPC.Wara li tneħħi bejn wieħed u ieħor l-ilma DEPC fil-ponta jew it-tubu EP, ippakkjaha u wrapha.
5. 121 grad Celsius, 30min
6. 180 grad Celsius, nixxef għal diversi sigħat (mill-inqas 3 sigħat)
Nota: a.Ilbes ingwanti tal-latex u maskri meta timmaniġġja DEPC!b, jew mingħajr sterilizzazzjoni DEPC, 130 ℃, 90min awtoklavi (ħafna laboratorji sterilizzazzjoni f'temperatura għolja darbtejn)
Konsiderazzjonijiet dwar l-estrazzjoni tal-RNA
Żewġ fenomeni ewlenin ta 'falliment tal-iżolament tal-RNA tat-tessut
Degradazzjoni tal-RNA u residwi ta' impuritajiet fit-tessuti,rigward id-degradazzjoni, ejja l-ewwel inħarsu lejn għaliex l-RNA estratt minn ċelluli kkultivati ma jiġix degradat faċilment.Ir-reaġenti eżistenti tal-estrazzjoni tal-RNA kollha fihom komponenti li jinibixxu malajr l-RNase.Żid il-lysate maċ-ċelloli kkultivati, u sempliċement ħawwadha, iċ-ċelloli kollha jistgħu jitħalltu sewwa mal-lysate, u ċ-ċelloli huma kompletament lisati.Wara li ċ-ċelloli jiġu lysed, l-ingredjenti attivi fil-lisat immedjatament jinibixxu l-RNase intraċellulari, sabiex l-RNA jibqa 'intatt.Jiġifieri, minħabba li ċ-ċelloli kkultivati jiġu kkuntattjati faċilment u bis-sħiħ mal-lisat, l-RNA tagħhom ma jiġix degradat faċilment;min-naħa l-oħra, l-RNA fit-tessut huwa faċilment degradat minħabba li ċ-ċelloli fit-tessut mhumiex faċli biex jikkuntattjaw malajr il-lisat.minħabba kuntatt suffiċjenti.Allura,jekk wieħed jassumi li hemm mod biex it-tessut jinbidel f'ċellula waħda filwaqt li jinibixxi l-attività tal-RNA, il-problema tad-degradazzjoni tista 'tiġi solvuta kompletament.
It-tħin tan-nitroġenu likwidu huwa l-aktar metodu effettiv bħal dan.Madankollu, il-metodu tat-tħin tan-nitroġenu likwidu huwa idejqek ħafna, speċjalment meta n-numru ta 'kampjuni huwa kbir.Dan ta lok għall-aqwa ħaġa li jmiss: l-omoġenizzatur.Il-omoġenizzaturmetodu ma jikkunsidrax il-kwistjoni ta 'kif l-attività RNase hija inibita qabel ma ċ-ċelloli jiġu kkuntattjati mal-lysate, iżda pjuttost jitlob li r-rata ta' tfixkil tat-tessuti hija aktar mgħaġġla mir-rata li biha RNase intraċellulari jiddegrada RN.
L-effett ta 'omoġenizzatur elettriku huwa aħjar,u l-effett tal-omoġenizzatur tal-ħġieġ huwa fqir, iżda b'mod ġenerali, il-metodu tal-omoġenizzatur ma jistax jipprevjeni l-fenomenu tad-degradazzjoni.Għalhekk, jekk l-estrazzjoni hija degradata, l-omoġenizzatur elettriku oriġinali għandu jintuża għat-tħin bin-nitroġenu likwidu;l-omoġenizzatur tal-ħġieġ oriġinali għandu jinbidel għal omoġenizzatur elettriku jew mitħun direttament b'nitroġenu likwidu.Il-problema hija kważi 100% fattibbli.tikseb solvuti.
Il-problema tar-residwi tal-impurità li taffettwa esperimenti sussegwenti għandha kawżi aktar diversi minn degradazzjoni, u s-soluzzjonijiet huma differenti b'mod korrispondenti.Fil-konklużjoni,jekk ikun hemm degradazzjoni jew impuritajiet residwi fit-tessut, il-metodu ta 'estrazzjoni/reaġent għall-materjal sperimentali speċifiku għandu jiġi ottimizzat.M'għandekx għalfejn tuża l-kampjuni prezzjużi tiegħek għall-ottimizzazzjoni: tista 'tixtri xi annimali żgħar bħal ħut/tiġieġ mis-suq, tieħu l-parti korrispondenti tal-materjal għall-estrazzjoni tal-RNA, u l-parti l-oħra għall-estrazzjoni tal-proteini - itħan bil-ħalq, l-istonku u l-imsaren Estratt.
L-RNA fil-mira tal-RNA estratt jintuża għal esperimenti ta 'segwitu differenti, u r-rekwiżiti ta' kwalità tiegħu huma differenti
Il-kostruzzjoni tal-librerija tal-cDNA teħtieġ integrità tal-RNA mingħajr residwi ta 'inibituri tar-reazzjoni tal-enżimi;Tramuntana teħtieġ integrità RNA ogħla u rekwiżiti aktar baxxi għal residwi ta 'inibituri ta' reazzjoni ta 'enżimi;RT-PCR ma jeħtieġx integrità għolja wisq tal-RNA,iżda jinibixxi r-reazzjonijiet tal-enżimi.Ir-rekwiżiti tar-residwi huma stretti.L-input jiddetermina l-output;kull darba li l-għan huwa li tinkiseb l-ogħla purità RNA, se tiswa lin-nies u l-flus.
Ġbir/Ħażna ta' Kampjuni
Fatturi li Jaffettwaw id-Degradazzjoni Wara li l-kampjun iħalli l-ġisem ħaj/jew l-ambjent tat-tkabbir oriġinali, l-enzimi endoġeni fil-kampjun jibdew jiddegradaw l-RNA,u r-rata ta 'degradazzjoni hija relatata mal-kontenut ta' enzimi endoġeni u temperatura.Tradizzjonalment, hemm biss żewġ modi biex tinibixxi kompletament l-attività ta 'enżimi endoġeni: żid lysate immedjatament u omoġenizza bir-reqqa u malajr;maqtugħ f'biċċiet żgħar u immedjatament iffriżat fin-nitroġenu likwidu.Iż-żewġ approċċi jeħtieġu tħaddim mgħaġġel.Dan tal-aħħar huwa adattat għall-kampjuni kollha, filwaqt li tal-ewwel huwa adattat biss għal tessuti b'kontenut baxx ta 'ċelloli u enzimi endoġeni u aktar faċli biex jiġu omoġenizzati.Speċifikament, it-tessut tal-pjanti, il-fwied, it-timu, il-frixa, il-milsa, il-moħħ, ix-xaħam, it-tessut tal-muskoli, eċċ huma l-aħjar iffriżati bin-nitroġenu likwidu qabel ma tipproċedi.
Frammentazzjoni u omoġenizzazzjoni tal-kampjuni
Fatturi li Jaffettwaw id-Degradazzjoni u r-Rendiment Il-frammentazzjoni tal-kampjun hijagħal omoġenizzazzjoni bir-reqqa, li huwa għal rilaxx sħiħ u sħiħ ta 'RNA.Iċ-ċelloli jistgħu jiġu omoġenizzati direttament mingħajr ma jitkissru.It-tessuti jistgħu jiġu omoġenizzati biss wara li jitkissru.Il-ħmira u l-batterji jeħtieġ li jitkissru b'enzimi korrispondenti qabel ma jkunu jistgħu jiġu omoġenizzati.Tessuti b'kontenut ta 'enżimi endoġeni aktar baxxi u omoġenizzazzjoni aktar faċli jistgħu jiġu mgħaffġa u omoġenizzati f'ħin wieħed fil-lisat permezz ta' omoġenizzatur;tessut tal-pjanti, fwied, timu, frixa, milsa, moħħ, xaħam, tessut tal-muskoli u kampjuni oħra, Huma jew għoljin f'enzimi endoġeni jew mhumiex omoġenizzati faċilment,għalhekk it-tfixkil tat-tessut u l-omoġenizzazzjoni għandhom isiru separatament.L-iktar metodu affidabbli u produttiv ta 'frammentazzjoni huwa t-tħin bin-nitroġenu likwidu, u l-aktar metodu affidabbli ta' omoġenizzazzjoni huwa l-użu ta 'omoġenizzatur elettriku.Nota speċjali dwar it-tħin bin-nitroġenu likwidu: il-kampjun m'għandux jinħall matul il-proċess kollu tat-tħin, peress li l-enzimi endoġeni huma aktar probabbli li jiffunzjonaw meta jiġu ffriżati.
Għażla ta' lisat
Li jaffettwaw il-konvenjenza tal-operat u l-fatturi ta 'impuritajiet endoġeni residwi Is-soluzzjonijiet ta' lysis użati b'mod komuni jistgħu kważi jinibixxu l-attività ta 'RNase.Għalhekk, il-punt ewlieni tal-għażla ta 'soluzzjoni ta' liżi huwa li tikkunsidra flimkien mal-metodu ta 'purifikazzjoni.Hemm eċċezzjoni waħda:kampjuni b'kontenut għoli ta 'enżimi endoġeni huma rrakkomandati li jużaw lisat li fih il-fenol biex tiżdied il-kapaċità li jinattivaw l-enzimi endoġeni.
Għażla tal-metodu ta 'purifikazzjoni
Fatturi li jaffettwaw impuritajiet endoġeni residwi, veloċità ta 'estrazzjoni Għal kampjuni nodfa bħal ċelloli, riżultati sodisfaċenti jistgħu jinkisbu bi kważi kull metodu ta' purifikazzjoni disponibbli.Iżda għal ħafna kampjuni oħra, speċjalment dawk b'livelli għoljin ta 'impuritajiet bħal pjanti, fwied, batterji, eċċ., L-għażla ta' metodu ta 'purifikazzjoni adattat hija kruċjali.Il-metodu ta 'purifikazzjoni ċentrifugali tal-kolonna għandu veloċità ta' estrazzjoni mgħaġġla u jista 'jneħħi b'mod effettiv l-impuritajiet li jaffettwaw ir-reazzjoni enżimatika sussegwenti tal-RNA, iżda huwa għali (Foregene jista' joffri kits kost-effettivi, aktar dettalji ikklikkjahawn);bl-użu ta 'metodi ta' purifikazzjoni ekonomiċi u klassiċi, bħal preċipitazzjoni LiCl, jista 'wkoll jikseb riżultati sodisfaċenti, iżda l-ħin tat-tħaddim huwa twil..
"Tliet Dixxiplini u Tmien Attenzjonijiet" għall-Estrazzjoni tal-RNA
Dixxiplina 1:Twaqqaf il-kontaminazzjoni ta 'enzimi eżoġeni.
Nota 1:Ilbes maskri u ingwanti strettament.
Nota 2:It-tubi taċ-ċentrifugi, l-irjus tat-Tip, il-vireg tal-pipetta, it-tankijiet tal-elettroforeżi, u l-bankijiet sperimentali involuti fl-esperiment għandhom jintremew sewwa.
Nota 3:Ir-reaġenti/soluzzjonijiet involuti fl-esperiment, speċjalment l-ilma, għandhom ikunu ħielsa minn RNase.
Dixxiplina 2:Imblokka l-attività ta 'enzimi endoġeni
Nota 4:Agħżel metodu ta' omoġenizzazzjoni xieraq.
Nota 5:Agħżel lisat xieraq.
Nota 6:Ikkontrolla l-ammont tal-bidu tal-kampjun.
Dixxiplina 3:Iċċara l-iskop tal-estrazzjoni tiegħek
Nota 7:Ma 'kwalunkwe sistema lysate toqrob l-ammont massimu tal-bidu tal-kampjun, ir-rata ta' suċċess ta 'estrazzjoni tinżel drastikament.
Nota 8:L-uniku kriterju ekonomiku għal estrazzjoni ta 'RNA b'suċċess huwa suċċess f'esperimenti sussegwenti, mhux rendiment.
Top 10 Sorsi ta 'Kontaminazzjoni RNase
1. Is-swaba 'huma l-ewwel sors ta' enzimi eżoġeni, għalhekk l-ingwanti għandhom jintlibsu u jinbidlu ta 'spiss.Barra minn hekk, il-maskri għandhom jintlibsu wkoll, minħabba li n-nifs huwa wkoll sors importanti ta 'enzimi.Benefiċċju addizzjonali ta 'l-ilbies ta' maskra ta 'ingwanti huwa li jipproteġi l-esperimentatur.
2. Truf tal-pipetta, tubi ċentrifugi, pipetti - RNase ma jistax jiġi inattivat bl-isterilizzazzjoni waħdu, għalhekk il-ponot tal-pipetti u tubi ċentrifugi għandhom jiġu ttrattati b'DEPC, anke jekk ikunu mmarkati bħala trattati DEPC.L-aħjar huwa li tuża pipetta għal skopijiet speċjali, imsaħha b'boċċa tal-qoton ta '75% alkoħol qabel l-użu, speċjalment il-virga;barra minn hekk, kun żgur li ma tużax tneħħija tar-ras.
3. L-ilma/buffer għandu jkun ħieles minn kontaminazzjoni RNase.
4. Mill-inqas it-tabella tat-test għandha tintmesaħ b'blalen tal-qoton ta '75% alkoħol.
5.Endogenous RNase It-tessuti kollha fihom enzimi endoġeni, għalhekk l-iffriżar ta 'malajr tat-tessuti b'nitroġenu likwidu huwa l-aħjar mod biex titnaqqas id-degradazzjoni.Il-metodu ta 'ħażna/tħin tan-nitroġenu likwidu huwa tabilħaqq inkonvenjenti, iżda huwa l-uniku mod għal tessuti b'livelli għoljin ta' enzimi endoġeni.
6. Kampjuni ta' RNA Prodotti ta' estrazzjoni ta' RNA jista' jkun fihom traċċi ta' kontaminazzjoni ta' RNase.
7. Estrazzjoni tal-plażmidi L-estrazzjoni tal-plażmidi ħafna drabi tuża Rnase biex tiddegrada l-RNA, u l-Rnase residwu għandu jiġi diġerit bi Proteinase K u estratt minn PCI.
8. Ħażna ta 'RNA Anke jekk tinħażen f'temperatura baxxa, traċċi ta' RNase se jikkawżaw degradazzjoni ta 'RNA.L-aħjar soluzzjoni għall-preservazzjoni fit-tul tal-RNA hija sospensjoni tal-melħ/alkoħol, minħabba li l-alkoħol jinibixxi l-attività enżimatika kollha f'temperaturi baxxi.
9. Meta l-cations (Ca, Mg) ikun fihom dawn il-joni, it-tisħin f'80C għal 5 minuti jikkawża li l-RNA jinqasam, għalhekk jekk l-RNA jeħtieġ li jissaħħan, is-soluzzjoni ta 'preservazzjoni jeħtieġ li jkun fiha aġent kelanti (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).
10. Enżimi użati f'esperimenti sussegwenti jistgħu jiġu kkontaminati minn RNase.
10 Suġġerimenti għall-estrazzjoni tal-RNA
1: Malajr jipprevjeni l-attività RNase.Il-kampjuni jiġu ffriżati malajr wara l-ġbir, u RNase jiġi inattivat b'operazzjoni rapida waqt il-liżi.
2: Agħżel metodu ta 'estrazzjoni xieraq għal tessut b'kontenut għoli ta' ribozyme, u t-tessut xaħmi huwa l-aħjar li juża l-metodu li fih il-fenol.
3: Il-kwalità tat-tbassir teħtieġ Tramuntana, il-kostruzzjoni tal-librerija cDNA teħtieġ integrità għolja, u RT-PCR u RPA (assaġġ ta 'protezzjoni tar-Ribonuclease) ma jeħtiġux integrità għolja.RT-PCR teħtieġ purità għolja (residwi ta 'inibituri ta' enzimi).
4: L-omoġenizzazzjoni bir-reqqa hija ċ-ċavetta għat-titjib tar-rendiment u t-tnaqqis tad-degradazzjoni.
5: Iċċekkja l-integrità tas-sejbien tal-elettroforeżi tal-RNA, 28S: 18S = 2: 1 huwa sinjal komplut, 1: 1 huwa wkoll aċċettabbli għall-biċċa l-kbira tal-esperimenti.
6: Tneħħija tad-DNA għal RT-PCR, analiżi tal-firxa L-aħjar huwa li tuża Dnase I biex tneħħi d-DNA.
7: Naqqas il-kontaminazzjoni ta 'enzimi eżoġeni - l-enzimi ma jistgħux jiġu importati minn barra.
8: Meta tikkonċentra aċidu nuklejku b'konċentrazzjoni baxxa, għandu jiżdied reaġent ta 'ko-preċipitazzjoni.Iżda biex jipprevjenu l-ko-preċipitant li jkun fih l-enzimi u l-kontaminazzjoni tad-DNA.
9: Ħoll sewwa l-RNA, jekk meħtieġ, saħħan f'65C għal 5 minuti.
metodu ta 'ħażna adattat
Jista 'jinħażen f'-20C għal żmien qasir, u f'-80C għal żmien twil.L-ewwel pass fit-titjib tar-rendimenti tal-RNA huwa li tirrealizza li l-kontenut tal-RNA ta 'kampjuni differenti jvarja ħafna.Abbundanza għolja (2-4ug/mg) bħal fwied, frixa, qalb, abbundanza medja (0.05-2ug/mg) bħal moħħ, embrijun, kliewi, pulmun, timu, ovarji, abbundanza baxxa (<0.05ug/mg) mg) bħal bużżieqa, għadam, xaħam.
1: Lyse ċelluli biex jirrilaxxaw RN - jekk l-RNA ma jiġix rilaxxat, ir-rendiment se jitnaqqas.L-omoġenizzazzjoni elettrika taħdem aħjar minn metodi oħra ta 'omoġenizzazzjoni, iżda tista' wkoll teħtieġ li tiġi kkombinata ma 'metodi oħra, bħal mashing tan-nitroġenu likwidu, diġestjoni enżimatika (Lysozyme/Lyticase)
2: Ottimizzazzjoni tal-metodu ta 'estrazzjoni.L-akbar problemi bil-metodi bbażati fuq il-fenol huma stratifikazzjoni mhux kompluta u telf parzjali ta 'RNA (is-supernatant ma jistax jitneħħa kompletament).Stratifikazzjoni mhux kompluta hija dovuta għal kontenut għoli ta 'aċidu nuklejku u proteina, li jistgħu jiġu solvuti billi jiżdied l-ammont ta' lisat użat jew jitnaqqas l-ammont ta 'kampjun.Pass ta 'estrazzjoni ta' kloroform ġie miżjud mat-tessut xaħmi.It-telf ta 'RNA jista' jitnaqqas permezz ta 'ippumpjar lura jew billi jitneħħa s-saff organiku segwit minn ċentrifugazzjoni.L-akbar problema bil-metodi bbażati fuq iċ-ċentrifugazzjoni tal-kolonna hija l-kampjun żejjed.
Għajnuniet dwar l-Estrazzjoni Klassika
1. Purifikazzjoni tal-fenol: Żid volum ugwali ta '1:1 Fenol/Kloroform u ħallat b'mod vigoruż għal 1-2 minuti.Iċċentrifuga b'veloċità għolja għal 2 minuti.Neħħi b'attenzjoni s-supernatant (80-90%).Qatt ma tasal fis-saff tan-nofs.Volum ugwali tas-soluzzjoni ta' reazzjoni jista' jiġi miżjud ma' Fenol/Kloroform u s-supernatant jitneħħa.Iż-żewġ supernatanti jistgħu jitħalltu flimkien għall-preċipitazzjoni tal-aċidu nuklejku biex itejbu r-rendiment.M'għandekx tkun ġentili wisq meta tħallat, u tippruvax tneħħi s-supernatant kollu.
2. Ħasil b'70-80% etanol: Waqt il-ħasil, l-aċidu nuklejku għandu jiġi sospiż biex jiġi żgurat li l-melħ residwu jinħasel.Fl-istess ħin, immedjatament wara li tferra 'l-etanol, ċentrifuga b'veloċità għolja għal ftit sekondi, u mbagħad neħħi l-etanol residwu b'pipetta.Dewweb wara li toqgħod f'temperatura tal-kamra għal 5-10 minuti.
11. Estrazzjoni ta' organizzazzjonijiet speċjali
1. Tessut fibruż: Iċ-ċavetta għall-estrazzjoni ta 'RNA minn tessut fibruż bħal qalb/muskolu skeletali hija li tfixkel kompletament it-tessut.Dawn it-tessuti għandhom densità baxxa taċ-ċelluli, għalhekk l-ammont ta 'RNA għal kull unità ta' piż ta 'tessut huwa baxx, u huwa aħjar li tuża kemm jista' jkun ammont tal-bidu.Kun żgur li itħan it-tessut sewwa taħt kundizzjonijiet ta 'iffriżar.
2. Tessuti b'kontenut għoli ta 'proteina/xaħam: il-kontenut ta' xaħam tal-moħħ/veġetali huwa għoli.Wara l-estrazzjoni PCI, is-supernatant fih flokkuli bojod.Is-supernatant għandu jiġi estratt mill-ġdid bil-kloroform.
3. Tessuti b'kontenut għoli ta 'aċidu nuklejku/ribożima: il-milsa/tim għandu kontenut għoli ta' aċidu nuklejku u ribożima.It-tessut tat-tħin taħt kundizzjonijiet ta 'iffriżar segwit minn omoġenizzazzjoni rapida jista' effettivament inattiva r-ribożimi.Madankollu, jekk il-lisat ikun viskuż wisq (minħabba kontenut għoli ta 'aċidu nuklejku), l-estrazzjoni PCI ma tkunx tista' tistratifika b'mod effettiv;iż-żieda ta 'aktar lisat tista' ssolvi din il-kwistjoni.Estrazzjonijiet multipli tal-PCI jistgħu jneħħu aktar DNA residwu.Jekk tifforma preċipitat abjad immedjatament wara li żżid l-alkoħol, dan jindika kontaminazzjoni tad-DNA.Estrazzjoni mill-ġdid b'PCI aċiduż wara x-xoljiment tista 'tneħħi l-kontaminazzjoni tad-DNA.
4. Tessut tal-pjanti: It-tessut tal-pjanti huwa aktar kumpless mit-tessut tal-annimali.Ġeneralment, il-pjanti huma mitħun taħt kundizzjonijiet ta 'nitroġenu likwidu, għalhekk id-degradazzjoni tal-RNA minn enzimi endoġeni mhix komuni.Jekk il-problema tad-degradazzjoni ma tiġix solvuta, kważi ċertament hija kkawżata minn impuritajiet li jinsabu fil-kampjun.L-impuritajiet li jinsabu f'ħafna pjanti se jwasslu għal residwi, u r-raġuni għar-residwi hija ħafna drabi minħabba li dawn l-impuritajiet għandhom xi xebh mal-RNA: inti tippreċipita u jien nippreċipita, u inti adsorbi u jien adsorbi.Dawn il-karatteristiċi jiddeterminaw li huma inibituri ta 'enżimi qawwija ħafna.
Fil-preżent, ir-reaġenti tal-estrazzjoni tal-RNA kummerċjali jistgħu jiġu adattati għal kważi t-tessuti tal-annimali kollha b'aġġustamenti żgħar, iżda hemm ftit reaġenti tal-estrazzjoni tal-RNA kummerċjali li jistgħu jkunu adattati għall-biċċa l-kbira tat-tessuti tal-pjanti.Fortunatament, Foregene jista 'jipprovdi speċjalikits ta' estrazzjoni ta' RNA tal-pjanti, għandnaKit tal-Iżolament tal-RNA Totali tal-Pjanti, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Dan ta 'l-aħħar huwa ddisinjat apposta għal pjanti b'kontenut għoli ta' polysaccharide u polyphenol.Għall-estrazzjoni tal-RNA, ir-rispons mill-utenti tal-laboratorju huwa partikolarment tajjeb.
12. L-effett tal-iffriżar u t-tidwib tal-kampjun Il-kampjun iffriżat jista 'jkun akbar, u jeħtieġ li jinqata' qabel ma jintuża għall-estrazzjoni tal-RNA.Il-kampjuni għandhom it-tendenza li jdubu (possibbilment parzjalment) waqt it-tqattigħ.Kampjuni ffriżati jista 'jkollhom bżonn jintiżnu qabel l-estrazzjoni tal-RNA, u t-tidwib definittivament se jseħħ matul dan il-proċess.Xi drabi, it-tidwib tal-kampjun iseħħ ukoll matul il-proċess tat-tħin tan-nitroġenu likwidu;jew il-kampjun iffriżat jiġi miżjud direttament mal-lisat mingħajr tħin tan-nitroġenu likwidu, u t-tidwib definittivament se jseħħ qabel l-omoġenizzazzjoni sħiħa.L-esperimenti wrew li t-tessut iffriżat huwa aktar suxxettibbli għad-degradazzjoni tal-RNA waqt it-tidwib milli t-tessut frisk.Ir-raġuni probabbli: Il-proċess tal-iffriżar u t-tidwib ifixkel l-istrutturi fiċ-ċellula, u jagħmilha aktar faċli għall-enzimi endoġeni biex jiġu f'kuntatt dirett mal-RNA.
13. Ġudizzju tal-kwalità tal-RNA Normalment, l-elettroforeżi tintuża biex tiġġudika l-integrità tal-RNA, u A260/A280 tintuża biex tiġġudika l-purità tal-RNA.Fit-teorija, l-RNA intatt għandu proporzjon ta '28S:18S = 2.7:1, u l-biċċa l-kbira tad-dejta tenfasizza l-proporzjon ta' 28S:18S = 2:1.Il-fatt hu li kważi l-ebda RNA estratt minn kampjuni għajr ċelluli mhu fi proporzjon ta '2:1 (dan inkiseb bl-użu tal-Agilent Bioanalyzer).
Ir-riżultati tal-elettroforeżi tal-RNA huma affettwati minn ħafna fatturi, inkluża struttura sekondarja, kundizzjonijiet tal-elettroforeżi, tagħbija tal-kampjun, grad ta 'saturazzjoni minn EB, eċċ. Uża elettroforeżi nattiva biex tiskopri RNA u uża DNA Marker bħala kontroll.Jekk il-28S f'2kb u l-18S f'0.9kb huma ċari, u 28S: 18S > 1, l-integrità tista 'tissodisfa r-rekwiżiti tal-biċċa l-kbira tal-esperimenti sussegwenti.
A260/A280 huwa indikatur li kkawża ħafna konfużjoni.L-ewwelnett, huwa meħtieġ li tiġi ċċarata t-tifsira oriġinali ta 'dan l-indikatur għall-aċidi nuklejċi: RNA pur, A260/280 tiegħu = madwar 2.0.RNA pur huwa l-'kawża' u A260/A280 = 2 huwa l-'effett'.Issa kulħadd qed juża A260/A280 bħala 'kawża', billi jaħseb li "jekk A260/A280 = 2, allura l-RNA huwa pur", li naturalment iwassal għal konfużjoni.
Jekk inti interessat, tista 'żżid ftit reaġent li spiss jintuża fl-estrazzjoni, bħal fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, eċċ., Mal-kampjun RNA tiegħek, u mbagħad kejjel il-proporzjon A260/A280.Ir-realtà hija li ħafna mir-reaġenti użati għall-estrazzjoni tal-RNA, kif ukoll ħafna impuritajiet fil-kampjun, jassorbu madwar A260 u A280, li jaffettwaw A260/A280.
L-aktar approċċ istruttiv fil-preżent huwa li jiġu skennjati kampjuni ta 'RNA fil-medda ta' 200-300 nm.Il-kurva ta 'RNA pur għandha l-karatteristiċi li ġejjin: il-kurva hija lixxa, A230 u A260 huma żewġ punti ta' inflessjoni, A300 huwa qrib 0, A260/A280 = madwar 2.0, u A260/A230 = madwar 2.0.Jekk id-dejta tal-iskannjar ma tkunx disponibbli, għandu jiġi determinat ukoll il-proporzjon A260/A230, peress li dan il-proporzjon huwa aktar sensittiv għat-trasferiment tal-impuritajiet kollha li jaffettwaw ir-reazzjoni enżimatika.Ikkunsidra l-firxa lineari tal-apparat (0.1–0.5 għal A260).
Hemm żewġ fenomeni utli oħra: il-proporzjon se jkun madwar 0.3 aktar baxx meta A260/A280 jitkejjel fl-ilma;filwaqt li l-proporzjon imkejjel f'10 mM EDTA huwa madwar 0.2 ogħla minn dak imkejjel f'1 mM EDTA.
Prodotti relatati:
Serje ta' iżolament RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Ħin tal-post: Lulju-15-2022
