L-esperiment RT-qPCR jinkludi estrazzjoni ta 'RNA u valutazzjoni tal-kwalità, traskrizzjoni inversa u qPCR tliet passi, kull pass għandu ħafna prekawzjonijiet, aħna se nintroduċu fid-dettall hawn taħt.

Ⅰ.Valutazzjoni tal-kwalità tal-RNA

Fl-esperiment RT-qPCR, wara t-tlestija tal-estrazzjoni tal-RNA, il-kwalità tal-RNA jeħtieġ li tiġi evalwata, u l-esperiment ta 'segwitu jista' jitwettaq biss wara li jkun ikkwalifikat.Metodi ta 'valutazzjoni jinkludu spettrofotometru, elettroforesi tal-ġel Agilent, analiżi Agilent 2100, fosthom l-aktar spettrofotometru użat komunement u skoperta tal-metodu tal-elettroforesi tal-ġel agarose.Għandu jiġi nnutat li dawn iż-żewġ metodi jeħtieġ li jintużaw flimkien biex jitlesta l-iskoperta u l-analiżi tal-konċentrazzjoni, il-purità u l-integrità tal-RNA, sabiex tiġi żgurata l-kwalità tal-RNA.

Kit tal-Iżolament tal-RNA Relatat: 

Kit ta' iżolament ta' RNA totali taċ-ċelluli

RNA totali purifikat ħafna u ta 'kwalità għolja jista' jinkiseb minn diversi ċelloli kkultivati ​​fi 11min.

Kit ta' iżolament ta' l-RNA totali ta' l-Annimali

Estratt malajr u b'mod effiċjenti RNA totali ta 'purità għolja u ta' kwalità għolja minn diversi tessuti tal-annimali.

Spettrofotometru:

L-ispettrofotometru jintuża prinċipalment biex jiddetermina l-konċentrazzjoni u l-purità tal-RNA, iżda ma jistax jiskopri l-integrità tal-RNA u residwu ġenomu.Fosthom, A260/280 u A260/230 huma parametri importanti għall-iskoperta tal-purità tal-RNA, u l-purità tal-RNA tista 'tiġi skoperta skont il-varjazzjoni tal-valuri tagħhom:

1. 1.9< A260/280< 2.1, li jindika li l-purità tal-RNA hija tajba;A260/280<1.9, li jindika li jista 'jkun hemm residwu ta' proteina fl-RNA;A260/280> 2.1, li jindika degradazzjoni parzjali possibbli ta 'RNA, li tista' tiġi kkonfermata aktar permezz ta 'elettroforesi tal-ġel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, li jindika li l-purità tal-RNA hija tajba;A260/230< 2.0, li jindika li jista 'jkun hemm residwi ta' reaġenti organiċi fl-RNA, bħal fenoli, etanol jew zokkor.

Elettroforeżi tal-ġel tal-agarose:

Assaġġ tal-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose jista 'janalizza l-integrità tal-RNA, il-ġenoma u r-residwi tal-proteini, iżda ma jistax jikkwantifika b'mod preċiż il-konċentrazzjoni tal-RNA jew jiskopri r-residwi ta' reaġenti organiċi.Ħu mudelli ta 'RNA ewkarjotiku pereżempju:

1. L-RNA kien soġġett għal elettroforeżi tal-ġel tal-agarose.Jekk kien hemm biss tliet meded singoli ta '28sRNA, 18sRNA u 5.8sRNA fuq il-mappa tal-ġel, dan jindika li l-RNA estratt huwa intatt.Jekk ikun hemm fenomenu tat-tkaxkir, dan jindika degradazzjoni parzjali tal-RNA.

2. Jekk ikun hemm faxxa qawwija waħda bejn it-toqba tal-kolla u l-faxxa 28sRNA, jista 'jkun hemm residwu tad-DNA ġenomika.

3. Jekk jidhru meded fit-toqba tal-kolla, tindika li jista 'jkun hemm residwi ta' proteina u sustanzi makromolekulari oħra.

Ⅱ. Traskrizzjoni inversa

Wara li titlesta l-estrazzjoni tal-RNA, jeħtieġ li tinqaleb f'cDNA għal esperimenti sussegwenti, għalhekk il-pass tat-treġġigħ lura huwa essenzjali.Traskrizzjoni inversa se tiġi introdotta mill-għażla tar-reverse transcriptase u primer:

Għażla tar-reverse transcriptase:

Ir-reverse transcriptases tipiċi jinkludu AMV RTase u MMLV RTase.L-RNase H ta 'AMV RTase għandu attività qawwija, tul ta' sintesi qasir, ammont baxx ta 'sintesi u stabbiltà termali tajba (42 ~ 55 ℃).L-attività RNase H ta 'MMLV RTase hija dgħajfa, it-tul tas-sintesi huwa twil, l-ammont tas-sintesi huwa għoli, u l-istabbiltà termali hija fqira (37 ~ 42 ℃).

Minħabba li l-enzima RNase H għandha l-funzjoni ta 'mudell ta' RNA degradanti, MMLV b'attività RNase H dgħajfa għandhom jintgħażlu preferenzjali waqt traskrizzjoni inversa, u wara inġinerija ġenetika aktar tard, l-istabbiltà termali ta 'MMLV laħqet qabża kwalitattiva.Teħid ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV għal traskrizzjoni inversa) bħala eżempju, hija reverse transcriptase ġdida espressa f'batterji maħduma minn E. coli bl-użu ta 'teknoloġija ta' rikombinazzjoni ġenetika.Hija polimerażi tad-DNA rikombinanti li tisintetizza linja tad-DNA komplementari minn RNA, DNA, jew ibridu RNA:DNA b'linja waħda.M'għandu l-ebda attività RNase H, stabbiltà qawwija, affinità qawwija ta 'RNA, u sensittività għolja ta' skoperta.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV għal traskrizzjoni inversa)

Għażla tal-primer:

Ġeneralment RT primers jaqgħu fi tliet kategoriji: oligo dT, primers każwali, u primers speċifiċi għall-ġeni.Agħżel primers adattati għall-użu skont rekwiżiti sperimentali differenti.

1. Jekk il-mudell huwa ta 'oriġini ewkarjotika u l-cDNA tard huwa użat għall-amplifikazzjoni PCR ta' rutina, Oligo (dT) huwa rakkomandat;Jekk l-esperiment sussegwenti jintuża biss għal qPCR, Oligo (dT) huwa rakkomandat li jitħallat ma 'primers każwali biex titjieb l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa.

2. Jekk il-mudell huwa minn prokarjoti, Random Primers jew primers speċifiċi għall-ġeni għandhom jintgħażlu għat-traskrizzjoni inversa.

Ⅲ.qPCR

Il-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza hija elaborata prinċipalment mill-għażla ta 'metodi kwantitattivi, prinċipji tad-disinn tal-primer, għażla ROX, konfigurazzjoni tas-sistema ta' reazzjoni u ssettjar ta 'kundizzjonijiet ta' reazzjoni, eċċ.

Għażla ta' metodi kwantitattivi:

Il-metodi kwantitattivi huma maqsuma f'metodi kwantitattivi relattivi u metodi kwantitattivi assoluti.Kwantifikazzjoni relattiva tista 'tintuża biex tiskopri l-effett ta' ċerti metodi ta 'trattament fuq l-espressjoni tal-ġeni, tiskopri d-differenza tal-espressjoni tal-ġeni f'ħinijiet differenti u tqabbel id-differenza tal-espressjoni tal-ġeni f'tessuti differenti.Kwantifikazzjoni assoluta tista 'tiskopri l-ammont ta' aċidu nuklejku fil-virus u l-bqija.Meta nagħmlu esperimenti, irridu nagħżlu l-metodi kwantitattivi xierqa skont l-esperimenti tagħna stess.

Prinċipji tad-disinn tal-primer:

Id-disinn tal-primer għall-qPCR huwa direttament relatat mal-effiċjenza tal-amplifikazzjoni u l-ispeċifiċità tal-prodott.Għalhekk, id-disinn korrett ta 'primers tajbin huwa l-ewwel pass ta' qPCR ta 'suċċess.Fid-disinn tal-primer, il-prinċipji li ġejjin għandhom jingħataw attenzjoni meta jintlaħaq il-prinċipju tad-disinn tal-primer konvenzjonali:

1. It-tul tal-framment fil-mira huwa kkontrollat ​​bejn 100 u 300 bp;

2. Disinn cross-exon biex tiġi evitata l-influwenza tad-DNA ġenomika;

3. Il-primers iddisinjati jeħtieġ li jiġu ttestjati għall-effiċjenza tal-amplifikazzjoni, u biss meta l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tilħaq l-istandard (90-110%) jistgħu jintużaw għal esperimenti kwantitattivi;

4. Il-konċentrazzjoni tal-primer hija ġeneralment ottimizzata bejn 0.1uM u 1.0uM.

Għażla ta'ROX:

Fil-proċess ta 'reazzjoni kwantitattiva, ROX jista' jaġġusta d-differenza fil-passaġġ ottiku, żball ta 'pipetta jew differenza ta' volum ikkawżat minn evaporazzjoni u kondensazzjoni b'mod uniformi, u jtejjeb ir-ripetibbiltà tar-riżultati.Madankollu, għandu jiġi nnutat li l-għażla ta 'ROX hija relatata mal-istrument.Jekk l-istrument qPCR għandu l-funzjoni li jikkoreġi awtomatikament id-differenza bejn it-toqob, m'għandux għalfejn iżid ROX;inkella, jeħtieġ li żżid il-korrezzjoni ROX.Imsieħba żgħar fix-xiri ta 'reaġenti għandhom ikunu skond l-istrument użat biex jagħżlu r-ROX korrett, jevitaw żbalji aktar tard.

Preparazzjoni tas-sistema ta' reazzjoni:

Volumi ta 'reazzjoni ta' 20ul u 50ul huma preferuti.Il-kwistjonijiet li ġejjin għandhom jingħataw attenzjoni meta tiġi fformulata s-sistema:

1. Is-sistema ta 'reazzjoni teħtieġ li tiġi ppreparata permezz ta' ventilazzjoni fil-bank tax-xogħol ultra-nadif, ddH ġdid₂O jintuża għal kull esperiment;

2. Kull esperiment jeħtieġ li jipprepara NTC biex jivverifika jekk hemmx tniġġis fis-sistema, u kull par ta 'primers jeħtieġ li jagħmel NTC meta jipprepara s-sistema;

3. Biex tiskopri jekk hemmx residwu tal-gDNA fil-mudell tal-RNA, NRT jista 'jiġi ppreparat għal kull kampjun għall-iskoperta;

4. Meta tħejji s-sistema, huwa rakkomandat li tagħmel mill-inqas 3 ripetizzjonijiet tekniċi għal kampjun wieħed;

5. Meta l-mudell huwa cDNA, huwa rakkomandat li tiddilwixxi 5-10 darbiet biex tnaqqas l-effett ta 'inibizzjoni tas-sistema ta' traskrizzjoni inversa fuq l-esperiment qPCR.Huwa aħjar li tesplora l-kwantità tal-mudell bil-gradjent, sabiex il-valur CT jaqa 'bejn 20-30;

6. Iddetermina n-numru meħtieġ ta 'reazzjonijiet, żid b'5-10% fuq il-bażi tan-numru ta' reazzjonijiet, u kkalkula n-numru tal-konfigurazzjoni tal-volum;

7, is-sistema hija ppreparata bl-użu tal-prinċipju tat-taħlita minn qabel, it-taħlit wara ċ-ċentrifugazzjoni u tiżgura l-ebda bżieżaq;

8, Sa fejn hu possibbli li tagħżel konsumabbli ta 'appoġġ.

Kit RT-qPCR relatat