Bażi tad-disinn tal-primer (99% problemi jistgħu jiġu solvuti)
1. Tul tal-primer: Il-ktieb tat-test jeħtieġ 15-30bp, ġeneralment madwar 20bp.Il-kondizzjoni attwali hija aħjar li tkun 18-24bp biex tiżgura l-ispeċifiċità, iżda iktar ma jkun twil l-aħjar, primer twil wisq se jnaqqas ukoll l-ispeċifiċità, u jnaqqas ir-rendiment.
2. Ispan ta 'amplifikazzjoni tal-Primer: 200-500bp huwa xieraq, u l-framment jista' jiġi estiż għal 10kb taħt kundizzjonijiet speċifiċi.
3. Primer bażi: Il-kontenut ta 'G + C għandu jkun 40-60%, ftit wisq effett ta' amplifikazzjoni G + C mhuwiex tajjeb, wisq G + C huwa faċli biex jidhru meded mhux speċifiċi.ATGC huwa mqassam bl-aħjar mod każwali, u jevita gruppi ta 'aktar minn 5 nukleotidi purini jew pirimidini.Multi-gc għat-tarf 5' u sekwenzi intermedji biex tiżdied l-istabbiltà, tevita GC sinjuri fit-tarf 3', l-ebda GC għall-aħħar 3 bażijiet, jew l-ebda GC għal 3 mill-aħħar 5 bażijiet.
4. Evita l-istruttura sekondarja fil-primers, u tevita l-kumplimentazzjoni bejn iż-żewġ primers, speċjalment il-kumplimentazzjoni fit-3 'tarf, inkella jiġi ffurmat dimer primer u se jiġu ġġenerati faxex amplifikati mhux speċifiċi.
5. Il-bażijiet fit-3 'tarf tal-primers, speċjalment il-bażijiet tal-aħħar u ta' qabel tal-aħħar, għandhom ikunu strettament imqabbla biex jiġi evitat falliment tal-PCR minħabba bażijiet terminali mhux paired.
6. Primers għandhom jew jistgħu jiġu miżjuda ma 'siti ta' qsim xierqa, u s-sekwenza fil-mira amplifikata għandu preferibbilment ikollha siti ta 'qsim xierqa, li huwa ta' benefiċċju kbir għall-analiżi tal-qsim jew il-klonazzjoni molekulari.
7. Speċifiċità ta' primers: primers m'għandux ikollhom omoloġija ovvja ma' sekwenzi oħra fid-database tas-sekwenza ta' l-aċidu nuklejku.
8. Tgħallem tuża softwer: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Dan id-disinn onlajn jaħdem l-aħjar).
Il-kontenut ta 'hawn fuq jista' jsolvi mill-inqas 99% tal-problemi tad-disinn tal-primer.
Ikkontrolla d-dettalji tad-disinn tal-primer
1. Tul tal-primer
It-tul tal-primer ġenerali huwa 18 ~ 30 bażi.B'mod ġenerali, l-aktar fattur importanti li jiddetermina t-temperatura tal-ittemprar tal-primer huwa t-tul tal-primer.It-temperatura tal-ittemprar tal-primer hija ġeneralment magħżula (valur Tm -5℃), u xi wħud jużaw direttament il-valur Tm.Il-formuli li ġejjin jistgħu jintużaw biex tikkalkula bejn wieħed u ieħor it-temperatura ta 'l-ittemprar ta' primers.
Meta t-tul tal-primer ikun inqas minn 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Meta t-tul tal-primer ikun akbar minn 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/tul-5℃
Barra minn hekk, ħafna softwer jista 'jintuża wkoll biex jikkalkula t-temperatura tal-ittemprar, il-prinċipju tal-kalkolu se jkun differenti, għalhekk xi kultant il-valur ikkalkulat jista' jkollu vojt żgħir.Biex jiġu ottimizzati r-reazzjonijiet tal-PCR, l-iqsar primers li jiżguraw temperaturi ta 'ttemprar ta' mhux inqas minn 54℃ jintużaw għall-aħjar effiċjenza u speċifiċità.
B'mod ġenerali, l-ispeċifiċità tal-primer tiżdied b'fattur ta 'erba' għal kull nukleotide addizzjonali, sabiex it-tul minimu tal-primer għall-biċċa l-kbira tal-applikazzjonijiet huwa 18-il nukleotide.Il-limitu ta 'fuq tat-tul tal-primer mhuwiex importanti ħafna, prinċipalment relatat mal-effiċjenza tar-reazzjoni.Minħabba l-entropija, iktar ma jkun twil il-primer, iktar tkun baxxa r-rata li biha tittempra biex tingħaqad mad-DNA fil-mira biex tifforma mudell stabbli b'strands doppji għad-DNA polymerase biex jorbot.
Meta tuża softwer biex tiddisinja primers, it-tul tal-primers jista 'jiġi ddeterminat mill-valur TM min-naħa tiegħu, speċjalment għal primers ta' PCR kwantitattiv ta 'fluworexxenza, TM = 60 ℃ jew hekk għandhom jiġu kkontrollati.
2.GC kontenut
Ġeneralment, il-kontenut ta 'G + C fis-sekwenzi primer huwa 40% ~ 60%, u l-kontenut GC u l-valur Tm ta' par ta 'primers għandhom jiġu kkoordinati.Jekk il-primer ikollu tendenza serja GC jew AT, ammont xieraq ta' denb A, T jew G u C jista' jiġi miżjud mat-tarf 5' tal-primer.
3. Temperatura ta 'l-ittemprar
It-temperatura ta 'l-ittemprar għandha tkun 5℃ aktar baxxa mit-temperatura tal-unchain.Jekk in-numru ta 'bażijiet tal-primer huwa żgħir, it-temperatura tal-ittemprar tista' tiżdied b'mod xieraq, li tista 'żżid l-ispeċifiċità tal-PCR.Jekk in-numru ta 'bażijiet huwa kbir, it-temperatura ta' l-ittemprar tista 'titnaqqas b'mod xieraq.Id-differenza fit-temperatura ta 'l-ittemprar bejn par primers ta' 4℃ ~ 6℃ mhux se taffettwa r-rendiment tal-PCR, iżda idealment it-temperatura ta 'l-ittemprar ta' par primers hija l-istess, li tista 'tvarja bejn 55℃ ~ 75℃.
4. Evita ż-żona tal-istruttura sekondarja tal-mudell tal-amplifikazzjoni
Huwa aħjar li tevita r-reġjun tal-istruttura sekondarja tal-mudell meta tagħżel il-framment amplifikat.L-istruttura sekondarja stabbli tal-framment fil-mira tista 'tiġi mbassra u stmata minn softwer tal-kompjuter rilevanti, li huwa ta' għajnuna għall-għażla tal-mudell.Riżultati sperimentali juru li l-espansjoni ħafna drabi ma tirnexxix meta l-enerġija ħielsa (△G) tar-reġjun li jrid jiġi estiż hija inqas minn 58.6lkJ/mol.
5. Ma jaqblux mad-DNA fil-mira
Meta s-sekwenza tad-DNA fil-mira amplifikata tkun kbira, primer jista' jorbot ma' partijiet multipli tad-DNA fil-mira, u dan jirriżulta f'meded multipli li jidhru fir-riżultat.Din id-darba huwa meħtieġ li tuża l-ittestjar tas-softwer BLAST, websajt:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Agħżel Allinja żewġ sekwenzi (bl2seq).
It-twaħħil tas-sekwenzi tal-primer maż-żona 1 u s-sekwenzi tad-DNA fil-mira għaż-żona 2 huwa interkambjabbli, u BLAST jikkalkula possibbiltajiet komplementari, antisens, u oħrajn, sabiex l-utenti m'għandhomx għalfejn jindunaw jekk iż-żewġ ktajjen humiex ktajjen tas-sens.Tista 'wkoll iddaħħal in-numru GI jekk taf in-numru GI tas-sekwenza fid-database, sabiex ma jkollokx għalfejn tippejstja sezzjoni kbira tas-sekwenza.Fl-aħħarnett, ikklikkja Allinja fi 3 biex tara jekk il-primer għandux siti omoloġi multipli fid-DNA fil-mira.
6. Primer terminal
It-tarf 3 'tal-primer huwa fejn tibda l-estensjoni, għalhekk huwa importanti li jiġi evitat li t-tqabbil ħażin jibda hemm.It-tarf 3 'm'għandux ikun aktar minn 3 G jew C konsekuttivi, għaliex dan jikkawża li l-primer jiġi attivat bi żball fir-reġjun tas-sekwenza ta' arrikkiment G+C.It-tarf 3 'ma jistax jifforma l-ebda struttura sekondarja, ħlief f'reazzjonijiet speċjali ta' PCR (AS-PCR), it-tarf 3' tal-primer ma jistax ikun imqabbel ħażin.Pereżempju, jekk ir-reġjun tal-kodifikazzjoni jiġi amplifikat, it-3 'tarf tal-primer m'għandux jintemm fit-tielet pożizzjoni tal-codon, minħabba li t-tielet pożizzjoni tal-codon hija suxxettibbli li tiddiġenera, li se taffettwa l-ispeċifiċità u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni.Meta tuża primers ta 'annessjoni, irreferi għat-tabella tal-użu tal-kodon, oqgħod attent għall-preferenza bijoloġika, tużax primers ta' anness fit-tarf 3′, u uża konċentrazzjoni ogħla ta 'primers (1uM-3uM).
7. Struttura sekondarja ta 'primers
Il-primers infushom m'għandux ikollhom sekwenzi komplementari, inkella l-primers infushom jintewa fi strutturi ta 'hairpin, u din l-istruttura sekondarja se taffettwa l-irbit ta' primers u mudelli minħabba tfixkil steriku.Jekk jintuża ġudizzju artifiċjali, il-bażijiet komplementari kontinwi tal-primers infushom m'għandhomx ikunu akbar minn 3bp.M'għandu jkun hemm l-ebda kumplimentarjetà bejn iż-żewġ primers, speċjalment il-koinċidenza komplementari tat-3 'tarf għandha tiġi evitata biex tiġi evitata l-formazzjoni ta' primer dimers.B'mod ġenerali, m'għandux ikun hemm aktar minn 4 bażijiet konsekuttivi omoloġija jew komplementarjetà bejn par ta 'primers.
8. Żid markaturi jew loci
It-tarf 5' għandu ftit effett fuq l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni u għalhekk jista' jiġi modifikat mingħajr ma jaffettwa l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni.Il-modifika tat-tarf tal-primer 5 inkludiet: iż-żieda ta' sit ta' restrizzjoni tal-enżimi;Bijotina ttikkettjata, fluworexxenza, digoxin, Eu3+, eċċ. Introduċi sekwenzi tad-DNA li jorbtu mal-proteini;L-introduzzjoni ta 'siti ta' mutazzjoni, inserzjoni u sekwenzi ta 'mutazzjoni nieqsa u introduzzjoni ta' sekwenzi promotur, eċċ Il-bażijiet żejda se jaffettwaw xi ftit jew wisq l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni u jżidu ċ-ċans ta' formazzjoni ta 'primer dimer, iżda għandhom isiru xi konċessjonijiet għall-pass li jmiss.Sekwenzi addizzjonali li ma jeżistux fuq is-sekwenza fil-mira, bħal siti ta 'restrizzjoni u sekwenzi promoturi, jistgħu jiġu miżjuda mat-tarf 5' tal-primer mingħajr ma jaffettwaw l-ispeċifiċità.Dawn is-sekwenzi mhumiex inklużi fil-kalkolu tal-valuri primer Tm, iżda għandhom jiġu ttestjati għall-komplimentarjetà u l-istruttura sekondarja interna.
9. Subkloni
Il-biċċa l-kbira tal-ħin, il-PCR huwa biss klonazzjoni preliminari, u mbagħad irridu nissottoklonu l-framment fil-mira f'diversi vettori, għalhekk għandna bżonn niddisinjaw bażijiet addizzjonali għall-operazzjoni li jmiss fil-pass tal-PCR.
Xi sekwenzi ddisinjati għas-subcloning huma miġbura fil-qosor hawn taħt.
Ġie miżjud sit ta' restrizzjoni ta' endonuclease ta' restrizzjoni
Iż-żieda ta' siti ta' restrizzjoni tal-enżimi hija l-aktar metodu użat komunement għas-subcloning tal-prodotti tal-PCR.Ġeneralment, is-sit tal-qsim huwa sitt bażijiet, minbarra l-5 'tarf tas-sit tal-qsim jeħtieġ li żżid 2 ~ 3 bażijiet protettivi.Madankollu, in-numru ta 'bażijiet protettivi meħtieġa minn enzimi differenti huwa differenti.Pereżempju, SalⅠ ma teħtieġ l-ebda bażi protettiva, EcoRⅤ teħtieġ bażi protettiva 1, NotⅠ teħtieġ 2 bażijiet protettivi, u Hind Ⅲ teħtieġ 3 bażijiet protettivi.
LIC iżid id-denb
L-isem sħiħ tal-LIC huwa klonazzjoni Indipendenti mill-Ligazzjoni, metodu ta 'klonazzjoni ivvintat minn Navogen speċifikament għall-parti tiegħu tal-vettur tal-pET.It-trasportatur tal-pET ippreparat bil-metodu LIC għandu truf li jwaħħlu ta 'linja waħda ta' bażi 12-15 mhux komplimentari, li jikkumplimentaw it-truf li jwaħħlu korrispondenti fuq il-framment tal-inserzjoni fil-mira.Għal skopijiet ta' amplifikazzjoni, is-sekwenza primer 5′ tal-framment imdaħħal għandha tikkumplimenta l-vettur LIC.L-attività estranect 3′→5′ tad-DNA polymerase T4 tista’ tifforma tarf li jwaħħal f’linja waħda fuq il-framment imdaħħal wara żmien qasir.Minħabba li l-prodott jista 'jiġi ffurmat biss mill-ittemprar reċiproku tal-framment tal-inserzjoni ppreparat u l-vettur, dan il-metodu huwa mgħaġġel ħafna u effiċjenti, u huwa klonazzjoni diretta.
Klon TA dirett żid denb
Il-klonazzjoni TA ma setgħetx timmira l-framment f'vettur, għalhekk aktar tard Invitrogen introduċa vettur li jista 'jimmira l-klonazzjoni, li kien fih erba' GTGGS bażi prominenti f'tarf wieħed.Għalhekk, fid-disinn ta 'primers tal-PCR, għandhom jiżdiedu sekwenzi komplementari kif xieraq, sabiex il-frammenti jkunu jistgħu jiġu "orjentati".
Jekk int qasir fil-ħin, tista 'tipprova sintesi diretta, li tgħaqqad il-ġene mal-vettur, li huwa dak li nsejħu s-sinteżi tal-ġene ET fil-muzekularisti.
D. Metodu ta 'klonazzjoni In-Fusion
Ebda ligase meħtieġa, l-ebda reazzjoni twila meħtieġa.Sakemm tiġi introdotta sekwenza fiż-żewġt itruf tal-vettur linearizzat Fid-disinn ta 'primers, allura l-prodott PCR u l-vettur linearizzat huma miżjuda fis-soluzzjoni ta' l-enżima tal-fużjoni li fiha BSA u mqiegħda f'temperatura ambjentali għal nofs siegħa, it-trasformazzjoni tista 'titwettaq.Dan il-metodu huwa partikolarment adattat għal konverżjoni ta 'volum kbir.
10. Għaqqad primer
Xi drabi, informazzjoni dwar is-sekwenza limitata biss hija magħrufa dwar id-disinn tal-primer.Pereżempju, jekk tkun magħrufa biss is-sekwenza ta 'aċidu amminiku, il-primer li jingħaqad jista' jiġi ddisinjat.Primer ta 'għaqda huwa taħlita ta' sekwenzi differenti li jirrappreżentaw il-possibbiltajiet bażi differenti kollha li jikkodifikaw aċidu amminiku wieħed.Biex iżżid l-ispeċifiċità, tista 'tirreferi għat-tabella tal-użu tal-kodon biex tnaqqas l-annessjoni skont il-preferenzi tal-użu bażi ta' organiżmi differenti.Hypoxanthine jista 'jitqabbel mal-bażijiet kollha biex titnaqqas it-temperatura ta' ttemprar tal-primer.Tużax il-bażijiet annessi fit-tarf 3′ tal-primer minħabba li l-ittemprar tal-aħħar 3 bażijiet fit-tarf 3′ huwa biżżejjed biex tibda PCR fis-sit ħażin.Jintużaw konċentrazzjonijiet ogħla ta' primer (1μM sa 3μM) minħabba li l-primers f'ħafna taħlitiet ta' annessi mhumiex speċifiċi għall-mudell fil-mira.
Materja prima tal-PCRkontroll
1. Kwantità tal-primer
Il-konċentrazzjoni ta 'kull primer hija 0.1 ~ 1umol jew 10 ~ 100pmol.Huwa aħjar li tipproduċi r-riżultat meħtieġ bl-inqas ammont ta 'primer.Konċentrazzjoni għolja ta 'primer se tikkawża nuqqas ta' tqabbil u amplifikazzjoni mhux speċifika, u żżid iċ-ċans li jiffurmaw dimeri bejn primers.
2. Konċentrazzjoni tal-primer
Il-konċentrazzjoni ta 'primers taffettwa l-ispeċifiċità.L-aħjar konċentrazzjoni tal-primer hija ġeneralment bejn 0.1 u 0.5μM.Konċentrazzjonijiet ogħla ta 'primer iwasslu għal amplifikazzjoni ta' prodotti mhux speċifiċi.
3. It-temperatura tal-ittemprar tal-primer
Parametru importanti ieħor għall-primers huwa t-temperatura tat-tidwib (Tm).Din hija t-temperatura meta 50% tal-primers u s-sekwenzi komplementari huma rappreżentati bħala molekuli tad-DNA bi stranded doppju.Tm huwa meħtieġ biex tissettja t-temperatura tal-ittemprar tal-PCR.Idealment, it-temperatura tal-ittemprar hija baxxa biżżejjed biex tiżgura ttemprar effettiv tal-primers bis-sekwenza fil-mira, iżda għolja biżżejjed biex tnaqqas l-irbit mhux speċifiku.Temperatura ta 'ttemprar raġonevoli minn 55 ℃ sa 70 ℃.It-temperatura ta 'l-ittemprar hija ġeneralment issettjata 5℃ inqas minn Tm tal-primer.
Hemm diversi formuli għall-issettjar ta 'Tm, li jvarjaw ħafna skond il-formula użata u s-sekwenza ta' primers.Minħabba li l-biċċa l-kbira tal-formuli jipprovdu valur Tm stmat, it-temperaturi kollha tal-ittemprar huma biss punt tat-tluq.L-ispeċifiċità tista 'tittejjeb billi jiġu analizzati diversi reazzjonijiet li jgħollu progressivament it-temperatura ta' l-ittemprar.Ibda taħt it-Tm-5℃ stmat, u gradwalment żid it-temperatura ta 'l-ittemprar f'inkrement ta' 2℃.Temperatura ogħla ta 'ttemprar se tnaqqas il-formazzjoni ta' primer dimers u prodotti mhux speċifiċi.Għall-aħjar riżultati, iż-żewġ primers għandu jkollhom valuri Tm approssimattivi.Jekk id-differenza Tm tal-pari tal-primer hija aktar minn 5 ℃, il-primers juru bidu falz sinifikanti billi tuża temperatura ta 'ttemprar aktar baxxa fiċ-ċiklu.Jekk iż-żewġ primers Tm huma differenti, issettja t-temperatura ta 'l-ittemprar għal 5℃ aktar baxxi mill-inqas Tm.Alternattivament, biex tiżdied l-ispeċifiċità, ħames ċikli jistgħu jitwettqu l-ewwel f'temperaturi ta 'ttemprar iddisinjati għal Tm ogħla, segwiti miċ-ċikli li jifdal f'temperaturi ta' ttemprar iddisinjati għal Tm aktar baxx.Dan jippermetti li tinkiseb kopja parzjali tal-mudell tad-destinazzjoni taħt kundizzjonijiet stretti.
4. Primer purità u stabbiltà
Il-purità standard tal-primers tad-dwana hija adegwata għall-biċċa l-kbira tal-applikazzjonijiet tal-PCR.It-tneħħija tal-gruppi benzoyl u isobutylyl permezz tat-tneħħija tal-melħ hija minima u għalhekk ma tinterferixxix mal-PCR.Xi applikazzjonijiet jeħtieġu purifikazzjoni biex jitneħħew kwalunkwe sekwenza mhux ta 'tul sħiħ fil-proċess ta' sinteżi.Dawn is-sekwenzi maqtugħin iseħħu minħabba li l-effiċjenza tal-kimika tas-sintesi tad-DNA mhix 100%.Dan huwa proċess ċirkolari li juża reazzjonijiet kimiċi ripetuti hekk kif kull bażi tiżdied biex tagħmel DNA minn 3′ sa 5′.Tista' tonqos f'kull ċiklu.Primers itwal, speċjalment dawk akbar minn 50 bażi, għandhom proporzjon kbir ta 'sekwenzi maqtugħin u jistgħu jeħtieġu purifikazzjoni.
Ir-rendiment tal-primers huwa affettwat mill-effiċjenza tal-kimika sintetika u l-metodu ta 'purifikazzjoni.Kumpaniji bijofarmaċewtiċi, bħal Cytology u Shengong, kollha jużaw unità OD minima biex jiżguraw il-produzzjoni totali ta 'oligonucleoside.Primers personalizzati jintbagħtu f'forma ta 'trab niexef.Huwa aħjar li jinħall mill-ġdid il-primers f'TE sabiex il-konċentrazzjoni finali tkun 100μM.TE huwa aħjar minn ilma dejonizzat minħabba li l-pH ta 'l-ilma ħafna drabi huwa aċiduż u jikkawża l-idroliżi ta' oligonukleosidi.
L-istabbiltà tal-primers tiddependi fuq il-kundizzjonijiet tal-ħażna.Trab niexef u primers maħlul għandhom jinħażnu f'-20 ℃.Primers maħlul f'TE f'konċentrazzjonijiet akbar minn 10μM jistgħu jinħażnu b'mod stabbli f'-20℃ għal 6 xhur, iżda jistgħu jinħażnu biss f'temperatura tal-kamra (15℃ sa 30℃) għal inqas minn ġimgħa.Primers tat-trab niexef jistgħu jinħażnu f'-20 C għal mill-inqas sena 1 u f'temperatura tal-kamra (15 C sa 30 C) sa xahrejn.
5. Enżimi u l-konċentrazzjonijiet tagħhom
Fil-preżent, il-polimerażi tad-DNA Taq użata hija bażikament l-enzima tal-inġinerija tal-ġeni sintetizzata minn batterji koliformi.L-ammont ta 'enzima meħtieġa biex tikkatalizza reazzjoni PCR tipika hija ta' madwar 2.5U (jirreferi għall-volum totali ta 'reazzjoni ta' 100ul).Jekk il-konċentrazzjoni hija għolja wisq, tista 'twassal għal amplifikazzjoni mhux speċifika;jekk il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq, l-ammont ta 'prodott sintetiku jitnaqqas.
6. Kwalità u konċentrazzjoni ta 'dNTP
Il-kwalità tad-dNTP hija relatata mill-qrib mal-konċentrazzjoni u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR.It-trab tad-dNTP huwa granulari, u l-varjabilità tiegħu titlef l-attività bijoloġika tiegħu jekk jinħażen b'mod mhux xieraq.Is-soluzzjoni dNTP hija aċiduża, u għandha tintuża f'konċentrazzjoni għolja, b'soluzzjoni buffer 1M NaOH jew 1M Tris.HCL biex taġġusta l-PH tagħha għal 7.0 ~ 7.5, ammont żgħir ta 'sub-imballaġġ, ħażna ffriżata f'-20 ℃.Iffriżar multiplu jiddegrada dNTP.Fir-reazzjoni tal-PCR, dNTP għandu jkun 50 ~ 200umol/L.Speċjalment, għandha tingħata attenzjoni lill-konċentrazzjoni ta 'l-erba' DNTPS għandha tkun ugwali (preparazzjoni mole ugwali).Jekk il-konċentrazzjoni ta 'xi wieħed minnhom hija differenti mill-oħrajn (ogħla jew aktar baxxi), ikun ikkawżat nuqqas ta' qbil.Konċentrazzjoni baxxa wisq tnaqqas ir-rendiment tal-prodotti PCR.dNTP jista 'jgħaqqad ma' Mg2 + u jnaqqas il-konċentrazzjoni ta 'Mg2 + ħieles.
7. Mudell (ġene fil-mira) aċidu nuklejku
L-ammont u l-grad ta 'purifikazzjoni ta' aċidu nuklejku template huwa wieħed mir-rabtiet ewlenin għas-suċċess jew il-falliment tal-PCR.Il-metodi tradizzjonali ta 'purifikazzjoni tad-DNA normalment jużaw SDS u protease K biex jiddiġerixxu u jarmu kampjuni.Il-funzjonijiet ewlenin tal-SDS huma: ħoll il-lipidi u l-proteini fuq il-membrana taċ-ċellula, u b'hekk teqred il-membrana taċ-ċellula billi tħoll il-proteini tal-membrana, u tiddissoċja proteini nukleari fiċ-ċellula, SDS tista 'wkoll tgħaqqad ma' proteini u tippreċipita;Protease K jista 'jidrolizza u jiddiġerixxi proteini, speċjalment histones marbuta mad-DNA, u mbagħad juża fenol solvent organiku u kloroform biex estratt proteini u komponenti oħra taċ-ċelluli, u juża etanol jew alkoħol isopropil biex jippreċipita l-aċidu nuklejku.L-aċidu nuklejku estratt jista' jintuża bħala mudell għal reazzjonijiet PCR.Għal kampjuni ta 'skoperta klinika ġenerali, metodu rapidu u sempliċi jista' jintuża biex jinħall iċ-ċelluli, lisati patoġeni, jiddiġerixxu u jitneħħew proteini mill-kromożomi għal ġeni fil-mira ħielsa, u użat direttament għall-amplifikazzjoni tal-PCR.L-estrazzjoni tal-mudell tal-RNA normalment tuża l-metodu ta 'guanidine isothiocyanate jew protease K biex tevita li RNase jiddegrada l-RNA.
8.Mg2 + konċentrazzjoni
Mg2+ għandu effett sinifikanti fuq l-ispeċifiċità u r-rendiment tal-amplifikazzjoni tal-PCR.B'reazzjoni ġenerali tal-PCR, meta l-konċentrazzjoni ta 'diversi dNTP hija 200umol/L, il-konċentrazzjoni xierqa ta' Mg2+ hija 1.5 ~ 2.0mmol/L.Il-konċentrazzjoni ta 'Mg2 + hija għolja wisq, l-ispeċifiċità tar-reazzjoni tonqos, isseħħ amplifikazzjoni mhux speċifika, konċentrazzjoni baxxa wisq tnaqqas l-attività ta' Taq DNA polymerase, li tirriżulta fit-tnaqqis tal-prodotti ta 'reazzjoni.
Il-joni tal-manjeżju jaffettwaw diversi aspetti tal-PCR, bħall-attività tal-polimerażi tad-DNA, li taffettwa r-rendiment;Eżempju ieħor huwa l-ittemprar tal-primer, li jaffettwa l-ispeċifiċità.dNTP u l-mudell jorbtu mal-jone tal-manjeżju, inaqqsu l-ammont ta 'jone tal-manjeżju ħieles meħtieġ għall-attività tal-enżima.L-aħjar konċentrazzjoni tal-jone tal-manjeżju tvarja għal pari u mudelli ta 'primer differenti, iżda konċentrazzjoni tipika tal-bidu tal-PCR b'200μM dNTP hija 1.5mM (nota: Għal PCR kwantitattiv f'ħin reali, uża soluzzjoni tal-jone tal-manjeżju 3 sa 5mM b'sonda fluworexxenti).Konċentrazzjonijiet ogħla ta 'jonji tal-manjeżju ħielsa iżidu r-rendiment, iżda jżidu wkoll l-amplifikazzjoni mhux speċifika u jnaqqsu l-fedeltà.Biex tiddetermina l-aħjar konċentrazzjoni, it-titrazzjonijiet tal-jone tal-manjeżju saru f'żidiet ta '0.5mM minn 1mM sa 3mM.Biex titnaqqas id-dipendenza fuq l-ottimizzazzjoni tal-jone tal-manjeżju, Platinum Taq DNA polymerase jista 'jintuża.Platinum Taq DNA polymerase huwa kapaċi jżomm il-funzjoni fuq firxa usa 'ta' konċentrazzjonijiet tal-jone tal-manjeżju minn Taq DNA polymerase u għalhekk jeħtieġ inqas ottimizzazzjoni.
9. Addittivi li jippromwovu l-Pcr
L-ottimizzazzjoni tat-temperatura tal-ittemprar, id-disinn tal-primer, u l-konċentrazzjoni tal-jone tal-manjeżju hija biżżejjed għal amplifikazzjoni speċifika ħafna tal-biċċa l-kbira tal-mudelli;madankollu, xi mudelli, inklużi dawk b'kontenut għoli ta' GC, jeħtieġu miżuri addizzjonali.L-addittivi li jaffettwaw it-temperatura tat-tidwib tad-DNA jipprovdu mod ieħor biex itejbu l-ispeċifiċità u r-rendiment tal-prodott.Denaturazzjoni sħiħa tal-mudell hija meħtieġa għall-aħjar riżultati.
Barra minn hekk, l-istruttura sekondarja tipprevjeni l-irbit tal-primer u l-estensjoni tal-enżimi.
L-addittivi tal-PCR, inklużi formamide, DMSO, glycerin, betaine, u PCRx Enhancer Solution, itejbu l-amplifikazzjoni.Il-mekkaniżmu possibbli tagħhom huwa li jnaqqsu t-temperatura tat-tidwib, u b'hekk jgħinu l-ittemprar tal-primers u jassistu l-estensjoni tad-DNA polymerase permezz tar-reġjun tal-istruttura sekondarja.Soluzzjoni PCRx għandha vantaġġi oħra.Ottimizzazzjoni minima tal-jone tal-manjeżju hija meħtieġa meta tintuża ma 'Platinum Taq DNA polymerase u Platinum Pfx DNA polymerase.Għalhekk, it-teknika tal-Platinum hija kkombinata mal-addittiv biex tiżdied l-ispeċifiċità filwaqt li tnaqqas id-dipendenza tat-tielet approċċ, l-ottimizzazzjoni tal-jone tal-manjeżju.Għall-aħjar riżultati, il-konċentrazzjoni ta 'addittivi għandha tiġi ottimizzata, speċjalment DMSO, formamide, u glycerol, li jinibixxu Taq DNA polymerase.
10. Bidu sħun
Il-PCR tal-bidu sħun huwa wieħed mill-aktar metodi importanti biex tittejjeb l-ispeċifiċità tal-PCR flimkien mad-disinn tal-primer tajjeb.Għalkemm it-temperatura ottimali ta 'titwil ta' Taq DNA polymerase hija 72 ℃, il-polimerażi tibqa 'attiva f'temperatura tal-kamra.Għalhekk, prodotti mhux speċifiċi huma prodotti meta t-temperatura taż-żamma tkun aktar baxxa mit-temperatura tal-ittemprar waqt il-preparazzjoni tar-reazzjoni tal-PCR u fil-bidu taċ-ċiklu termali.Ladarba ffurmati, dawn il-prodotti mhux speċifiċi huma amplifikati b'mod effettiv.Il-PCR hot-start huwa partikolarment effettiv meta s-siti użati għad-disinn tal-primer huma limitati mill-post tal-elementi ġenetiċi, bħal mutazzjonijiet diretti lejn is-sit, klonazzjoni tal-espressjoni, jew kostruzzjoni u manipulazzjoni ta 'elementi ġenetiċi użati għall-inġinerija tad-DNA.
Metodu komuni biex tillimita l-attività ta 'Taq DNA polymerase huwa li tipprepara soluzzjoni ta' reazzjoni PCR fuq is-silġ u poġġiha f'apparat PCR imsaħħan minn qabel.Dan il-metodu huwa sempliċi u mhux għali, iżda ma jlestix l-attività tal-enzima u għalhekk ma jeliminax kompletament l-amplifikazzjoni ta 'prodotti mhux speċifiċi.
Il-priming termali jdewwem is-sintesi tad-DNA billi jinibixxi komponent essenzjali sakemm l-apparat tal-PCR jilħaq it-temperatura tad-denaturazzjoni.Il-biċċa l-kbira tal-metodi ta 'bidu termali manwali, inkluż iż-żieda mdewma ta' Taq DNA polymerase, huma ingombranti, speċjalment għal applikazzjonijiet b'rendiment għoli.Metodi oħra ta 'priming termali jużaw ilqugħ tax-xama' biex jagħlqu komponent essenzjali, inklużi joni jew enzimi tal-manjeżju, jew biex jiżolaw fiżikament komponenti reattivi, bħal mudelli u buffers.Matul iċ-ċiklu termali, il-komponenti varji huma rilaxxati u mħallta flimkien hekk kif ix-xama 'tinħall.Bħall-metodu manwali tal-bidu sħun, il-metodu ta 'lqugħ tax-xama' huwa ingombranti u suxxettibbli għall-kontaminazzjoni u mhuwiex adattat għal applikazzjonijiet ta 'produzzjoni għolja.
Il-polimerażi tad-DNA tal-platinu hija konvenjenti u effiċjenti għal PCR awtomatika tal-bidu sħun.Platinum Taq DNA polymerase jikkonsisti f'Taq DNA polymerase rikombinanti flimkien ma' antikorp monoklonali kontra Taq DNA polymerase.L-antikorpi huma fformulati permezz tal-PCR biex jinibixxu l-attività tal-enżimi waqt iż-żamma fit-temperatura fit-tul.Taq DNA polymerase ġie rilaxxat fir-reazzjoni matul l-insulazzjoni ta '94 ℃ tal-pass ta' denaturazzjoni, u rrestawra l-attività sħiħa tal-polimerażi.B'kuntrast ma 'Taq DNA polimerażi modifikata kimikament għall-bidu termali, l-enżima tal-Platinum ma teħtieġx insulazzjoni fit-tul f'94 ℃ (10 sa 15-il minuta) biex tattiva l-polimerażi.Bi PlatinumTaq DNA polymerase, 90% tal-attività Taq DNA polymerase ġiet restawrata wara 2 minuti f'94℃.
11. Nest-PCR
Rounds suċċessivi ta 'amplifikazzjoni bl-użu ta' primers nested jistgħu jtejbu l-ispeċifiċità u s-sensittività.L-ewwel rawnd huwa amplifikazzjoni standard ta '15 sa 20 ċiklu.Frazzjoni żgħira tal-prodott ta 'amplifikazzjoni inizjali ġiet dilwita 100 sa 1000 darba u miżjuda mat-tieni rawnd ta' amplifikazzjoni għal 15 sa 20 ċiklu.Alternattivament, il-prodott amplifikat inizjali jista 'jitqies permezz ta' purifikazzjoni tal-ġel.Primer nested jintuża fit-tieni rawnd ta 'amplifikazzjoni, li jista' jorbot mas-sekwenza fil-mira ġewwa l-ewwel primer.L-użu ta 'nested PCR inaqqas il-possibbiltà ta' amplifikazzjoni ta 'siti multipli fil-mira minħabba li hemm ftit sekwenzi fil-mira komplementari għaż-żewġ settijiet ta' primers.L-istess numru totali ta 'ċikli (30 sa 40) bl-istess primers amplifikaw is-siti mhux speċifiċi.PCR nested iżid is-sensittività ta 'sekwenzi mmirati limitati (eż., mrnas rari) u jtejjeb l-ispeċifiċità ta' PCRS diffiċli (eż. 5' RACE).
12. PCR Dixxendenti
PCR dixxendenti jtejjeb l-ispeċifiċità billi juża kundizzjonijiet ta 'ttemprar stretti għall-ewwel ftit ċikli ta' PCR.Iċ-ċiklu jibda f'temperatura ta 'l-ittemprar ta' madwar 5℃ ogħla mit-Tm stmat, imbagħad kull ċiklu jitnaqqas b'1℃ sa 2℃ sakemm it-temperatura ta 'l-ittemprar tkun taħt it-Tm 5℃.Il-mudell tad-destinazzjoni biss bl-ogħla omoloġija se jiġi amplifikat.Dawn il-prodotti jkomplu jespandu f'ċikli sussegwenti, u jeliminaw il-prodotti mhux speċifiċi amplifikati.PCR dixxendenti huwa utli għal metodi fejn il-grad ta 'omoloġija bejn il-primer u l-mudell fil-mira mhux magħruf, bħall-marki tas-swaba' tad-DNA AFLP.
Kits PCR Relatati
L-Eroj 2 × PCRTMIs-sistema tat-taħlita għandha tolleranza ogħla għall-inibituri tal-PCR mis-sistema ordinarja tal-PCR Mix, u tista 'faċilment tlaħħaq mal-amplifikazzjoni tal-PCR ta' diversi mudelli kumplessi.Is-sistema ta 'reazzjoni unika u Taq Hero ta' effiċjenza għolja jagħmlu r-reazzjoni tal-PCR ikollha effiċjenza, speċifiċità u sensittività ta 'amplifikazzjoni ogħla.
Effiċjenza ogħla ta 'amplifikazzjoni
Għandu attività 5'→3' DNA polymerase u attività 5'→3' exonuclease, mingħajr attività 3'→5' exonuclease.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Speċifiku—buffer ottimizzat u enzima Taq hot-start jistgħu jipprevjenu amplifikazzjoni mhux speċifika u formazzjoni ta' primer dimer
Sensittività għolja—jistgħu jiskopru kopji baxxi tal-mudell
Il-kit juża reaġent tat-traskrizzjoni inversa Foregene uniku u Foregene HotStar Taq DNA Polymerase flimkien ma 'sistema ta' reazzjoni unika biex ittejjeb b'mod effettiv l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni u l-ispeċifiċità tar-reazzjoni.
Ħin tal-post: Mejju-09-2023
