Ebda sinjali ta 'amplifikazzjoni

1.It-Taq DNA Polymerase fil-kit jitlef l-attività tiegħu minħabba ħażna mhux xierqa jew skadenza tal-kit.
Rakkomandazzjoni: Ikkonferma l-kundizzjonijiet tal-ħażna tal-kit;żid mill-ġdid ammont xieraq ta' Taq DNA Polymerase mas-sistema tal-PCR jew tixtri Kit tal-PCR Real Time ġdid għal esperimenti relatati.

2.Hemm ħafna inibituri ta 'Taq DNA Polymerase fil-mudell tad-DNA.
Suġġeriment: Ippurifika mill-ġdid il-mudell jew tnaqqas l-ammont ta 'mudell użat.

3.Il-konċentrazzjoni Mg2 + mhix adattata.
Rakkomandazzjoni: Il-konċentrazzjoni Mg2 + ta 'the2 × Real PCR Mix li nipprovdu hija 3.5mM.Madankollu, għal xi primers u mudelli speċjali, il-konċentrazzjoni ta 'Mg2+ tista' tkun ogħla.Għalhekk, tista 'żżid direttament MgCl2 biex tottimizza l-konċentrazzjoni ta' Mg2 +.Huwa rakkomandat li tiżdied l-Mg2 + 0.5mM kull darba għall-ottimizzazzjoni.

4.Il-kundizzjonijiet ta 'amplifikazzjoni tal-PCR mhumiex adattati, u s-sekwenza jew il-konċentrazzjoni tal-primer mhix xierqa.
Suġġeriment: ikkonferma l-korrettezza tas-sekwenza tal-primer u l-primer ma ġiex degradat;jekk is-sinjal ta 'amplifikazzjoni ma jkunx tajjeb, ipprova tbaxxi t-temperatura ta' l-ittemprar u aġġusta l-konċentrazzjoni tal-primer b'mod xieraq.

5.L-ammont ta 'mudell huwa ftit wisq jew wisq.
Rakkomandazzjoni: Wettaq dilwizzjoni tal-gradjent tal-linearizzazzjoni tal-mudell, u agħżel il-konċentrazzjoni tal-mudell bl-aħjar effett PCR għall-esperiment tal-PCR Real Time.

NTC għandu valur ta 'fluworexxenza għoli wisq

1.Kontaminazzjoni tar-reaġent ikkawżata waqt it-tħaddim.
Rakkomandazzjoni: Ibdel b'reaġenti ġodda għal esperimenti Real Time PCR.

2.Kontaminazzjoni seħħet waqt il-preparazzjoni tas-sistema ta 'reazzjoni PCR.
Rakkomandazzjoni: Ħu l-miżuri protettivi meħtieġa waqt it-tħaddim, bħal: tilbes ingwanti tal-lattiċe, tuża ponta tal-pipetta b'filtru, eċċ.

3.Il-primers huma degradati, u d-degradazzjoni tal-primers se tikkawża amplifikazzjoni mhux speċifika.
Suġġeriment: Uża l-elettroforesi SDS-PAGE biex tiskopri jekk il-primers humiex degradati, u tibdilhom b'primers ġodda għal esperimenti Real Time PCR.

Primer dimer jew amplifikazzjoni mhux speċifika

1.Il-konċentrazzjoni Mg2 + mhix adattata.
Rakkomandazzjoni: Il-konċentrazzjoni Mg2+ tat-2× Real PCR EasyTM Mix li nipprovdu hija 3.5 mM.Madankollu, għal xi primers u mudelli speċjali, il-konċentrazzjoni ta 'Mg2+ tista' tkun ogħla.Għalhekk, tista 'żżid direttament MgCl2 biex tottimizza l-konċentrazzjoni ta' Mg2 +.Huwa rakkomandat li tiżdied l-Mg2 + 0.5mM kull darba għall-ottimizzazzjoni.

2.It-temperatura tal-ittemprar tal-PCR hija baxxa wisq.
Suġġeriment: Żid it-temperatura tal-ittemprar tal-PCR b'1℃ jew 2℃ kull darba.

3.Il-prodott PCR huwa twil wisq.
Rakkomandazzjoni: It-tul tal-prodott Real Time PCR għandu jkun bejn 100-150bp, mhux aktar minn 500bp.

4.Il-primers huma degradati, u d-degradazzjoni tal-primers se twassal għad-dehra ta 'amplifikazzjoni speċifika.
Suġġeriment: Uża l-elettroforesi SDS-PAGE biex tiskopri jekk il-primers humiex degradati, u tibdilhom b'primers ġodda għal esperimenti Real Time PCR.

5.Is-sistema PCR mhix xierqa, jew is-sistema hija żgħira wisq.
Suġġeriment: Is-sistema ta 'reazzjoni tal-PCR hija żgħira wisq tikkawża li l-eżattezza tas-sejbien tonqos.L-aħjar huwa li tuża s-sistema ta 'reazzjoni rakkomandata mill-istrument PCR kwantitattiv biex terġa' tmexxi l-esperiment Real Time PCR.

Ripetibbiltà fqira tal-valuri kwantitattivi

1.L-istrument qed jaħdem ħażin.
Suġġeriment: Jista 'jkun hemm żbalji bejn kull toqba tal-PCR tal-istrument, li jirriżulta f'riproduċibbiltà fqira waqt il-ġestjoni jew l-iskoperta tat-temperatura.Jekk jogħġbok iċċekkja skont l-istruzzjonijiet tal-istrument korrispondenti.

2.Il-purità tal-kampjun mhix tajba.
Rakkomandazzjoni: Kampjuni impuri se jwasslu għal riproduċibbiltà fqira tal-esperiment, li tinkludi l-purità tal-mudell u l-primers.L-aħjar huwa li terġa 'tipurifika l-mudell, u l-primers huma l-aħjar purifikati minn SDS-PAGE.

3.Il-preparazzjoni tas-sistema PCR u l-ħin tal-ħażna huwa twil wisq.
Suġġeriment: Uża s-sistema tal-PCR Real Time għall-esperiment tal-PCR immedjatament wara l-preparazzjoni, u tħallihiex imwarrba għal żmien twil wisq.

4.Il-kundizzjonijiet ta 'amplifikazzjoni tal-PCR mhumiex adattati, u s-sekwenza jew il-konċentrazzjoni tal-primer mhix xierqa.
Suġġeriment: ikkonferma l-korrettezza tas-sekwenza tal-primer u l-primer ma ġiex degradat;jekk is-sinjal ta 'amplifikazzjoni ma jkunx tajjeb, ipprova tbaxxi t-temperatura ta' l-ittemprar u aġġusta l-konċentrazzjoni tal-primer b'mod xieraq.

5.Is-sistema PCR mhix xierqa, jew is-sistema hija żgħira wisq.
Suġġeriment: Is-sistema ta 'reazzjoni tal-PCR hija żgħira wisq tikkawża li l-eżattezza tas-sejbien tonqos.L-aħjar huwa li tuża s-sistema ta 'reazzjoni rakkomandata mill-istrument PCR kwantitattiv biex terġa' tmexxi l-esperiment Real Time PCR.