Speċifiċità ta' skoperta
Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, l-iskop tad-disinn tal-primer huwa li timmassimizza l-ispeċifiċità tal-PCR.Dan huwa determinat mill-influwenza bejn wieħed u ieħor prevedibbli ta 'ħafna varjabbli.Varjabbli importanti waħda hija s-sekwenza fit-3′tarf tal-primer.
Importanti, l-assaġġi tal-PCR iddisinjati għall-ispeċifiċità huma aktar probabbli li jżommu effiċjenza għolja fuq firxa dinamika wiesgħa, minħabba li l-assaġġ ma jipproduċix prodotti ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi, u b'hekk jikkompetu mar-reaġenti tal-PCR jew jinibixxi r-reazzjoni ewlenija tal-amplifikazzjoni.
Naturalment, f'xi każijiet, l-ispeċifiċità mhix l-aktar importanti, pereżempju, meta l-għan huwa li jiġu kkwantifikati patoġeni relatati mill-qrib iżda differenti, huma meħtieġa standards speċjali ta 'disinn, ottimizzazzjoni u verifika.
Il-kurva tat-tidwib hija metodu standard għall-valutazzjoni tal-ispeċifiċità tal-amplicons, tal-inqas f'termini ta 'jekk amplifikati mira waħda.Madankollu, għandu jiġi enfasizzat li l-kurvi tat-tidwib jistgħu jkunu qarrieqa għaliex, pereżempju, jistgħu jiġu affettwati mill-effetti magħquda ta 'primers subottimali u konċentrazzjonijiet baxxi ta' template.
P5 |Il-kurva tat-tidwib turi ċ-ċaqliq tat-Tm miksuba minn żewġ skoperti ta 'ammonti differenti ta' żewġ DNAs fil-mira.
A. F'konċentrazzjonijiet ogħla (ad)), m'hemm l-ebda primer dimer ovvju wara li jitlesta l-kejl tal-qPCR.Hekk kif il-konċentrazzjoni tal-mudell tonqos għal 50 kopja (e), prodott mhux speċifiku jibda jidher u jsir l-uniku prodott fl-inqas konċentrazzjoni (f).
B. It-test irreġistra l-istess Tms fil-konċentrazzjonijiet immirati kollha, u ma kien hemm l-ebda primer dimer ovvju anki fl-inqas konċentrazzjoni (5 kopji).Meta użaw dawn iż-żewġ metodi ta 'skoperta, ma nstabu l-ebda prodotti ta' amplifikazzjoni fl-NTCs.
P5 juri l-kurvi ta' dissoluzzjoni miksuba b'kampjuni li fihom il-mudell huwa preżenti f'konċentrazzjonijiet differenti.P 5a juri li fiż-żewġ konċentrazzjonijiet l-aktar baxxi, it-Tms tal-prodotti ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi prodotti huma aktar baxxi minn dak tal-amplicons speċifiċi.
Ovvjament, dan il-metodu ta 'detezzjoni ma jistax jintuża b'mod affidabbli biex jinstabu miri li jeżistu f'konċentrazzjonijiet baxxi.
Interessanti, l-NTCs, jiġifieri, kampjuni bl-ebda DNA għal kollox, ma rreġistrawx prodotti ta 'amplifikazzjoni (mhux speċifiċi), li jindikaw li d-DNA ġenomika fl-isfond jista' jipparteċipa f'amplifikazzjoni/polimerizzazzjoni mhux speċifika.
Xi drabi tali primers fl-isfond u amplifikazzjoni mhux speċifika ma jistgħux jiġu rimedjati, iżda ħafna drabi huwa possibbli li jiġi ddisinjat metodu ta 'skoperta li ma jkollux amplifikazzjoni mhux speċifika fi kwalunkwe konċentrazzjoni ta' mudell u NTC (P 5b).
Hawnhekk, anki r-reġistrazzjoni tal-amplifikazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-mira b'Cq ta '35 se tipproduċi kurva ta' dissoluzzjoni speċifika.Bl-istess mod, NTCs ma wrew l-ebda sinjali ta 'amplifikazzjoni mhux speċifika.Xi drabi, l-imġieba ta 'skoperta tista' tkun dipendenti fuq il-likur omm, u amplifikazzjoni mhux speċifika biss tiġi skoperta f'ċerti kompożizzjonijiet ta 'buffer, li jistgħu jkunu relatati ma' konċentrazzjonijiet differenti ta 'Mg2+.
Stabbiltà ta 'skoperta
L-ottimizzazzjoni ta 'Ta hija pass utli fil-verifika empirika u l-proċess ta' ottimizzazzjoni ta 'skoperta qPCR.Tipprovdi indikazzjoni diretta tar-robustezza tas-sett tal-primer billi turi t-temperatura (jew il-firxa tat-temperatura) li tipproduċi l-inqas Cq mingħajr ma jamplifika l-NTC.
Id-differenza minn darbtejn sa erba 'darbiet fis-sensittività tista' ma tkunx importanti għal nies b'espressjoni għolja ta 'mRNA, iżda għal testijiet dijanjostiċi, tista' tfisser id-differenza bejn riżultati pożittivi u negattivi foloz.
Il-proprjetajiet Ta tal-qPCR primers jistgħu jvarjaw ħafna.Xi testijiet mhumiex robusti ħafna, u jekk ma jsirux taħt l-aħjar valur Ta tal-primers, dawn se jikkrollaw malajr.
Dan huwa importanti għaliex dan it-tip ta 'skoperta ħafna drabi huwa problematiku fid-dinja reali, u l-purità tal-kampjun, il-konċentrazzjoni tad-DNA, jew il-preżenza ta' DNA ieħor jistgħu ma jkunux ottimali.
Barra minn hekk, in-numru tal-kopja fil-mira jista 'jvarja f'firxa wiesgħa, u r-reaġenti, utensili tal-plastik, jew strumenti jistgħu jkunu differenti minn dawk użati meta jitwaqqaf it-test.
P6|Il-gradjent tat-temperatura juri r-robustezza differenti tas-sejbien tal-PCR.
A. Uża l-Mastermix Sensifast SYBR ta' Bioline (numru tal-katalgu BIO-98050) biex twettaq PCR fuq cDNA ippreparat minn RNA tal-moħħ uman.
B. Uża l-istrument CFX qPCR ta' Bio-Rad biex tirreġistra l-mappa ta' amplifikazzjoni u l-kurva ta' dissoluzzjoni ta' apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCCTAGG).
C. Grafika ta' amplifikazzjoni u kurva tat-tidwib ta' ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Grafika ta' amplifikazzjoni u kurva ta' dissoluzzjoni ta' GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs irreġistrati f'temperaturi ta 'ttemprar differenti, li juru d-differenza f'Cq irreġistrati taħt gradjent ta' temperatura ta '7C.
P 6 juri riżultat tipiku ta 'test mhux mixtieq, fejn qPCR twettaq bl-użu ta' gradjent Tas bejn 59C u 67C (P 6a), bl-użu ta 'primers għal tliet ġeni speċifiċi għall-moħħ tal-bniedem.
Jista 'jidher mill-graff ta' amplifikazzjoni li l-primers Opalin huma 'l bogħod mill-ideali minħabba li l-firxa Ta ottimali tagħhom hija dejqa ħafna (Figura 6b), jiġifieri, Cqs huma mxerrda ħafna, u dan jirriżulta f'Cqs imqabbel b'mod sinifikanti mal-Cqs ottimali Baxx tagħhom.
Dan il-metodu ta' skoperta huwa instabbli u jista' jwassal għal amplifikazzjoni subottimali.Għalhekk, dan il-par ta 'primers għandu jiġi ddisinjat mill-ġdid.Barra minn hekk, l-analiżi tal-kurva tat-tidwib (daħla) turi li l-ispeċifiċità ta 'dan il-metodu ta' skoperta tista 'wkoll tkun problematika, minħabba li l-kurva tat-tidwib ta' kull Ta hija differenti.
Il-metodu ta 'skoperta ACSBG1 muri f'P 6c huwa aktar robust mill-metodu ta' sejbien ta 'Opalin hawn fuq, iżda għadu 'l bogħod mill-ideali, u huwa probabbli li jista' jittejjeb.
Madankollu, aħna nenfasizzaw li m'hemm l-ebda konnessjoni meħtieġa bejn ir-robustezza u l-ispeċifiċità, minħabba li l-kurva ta 'dissoluzzjoni prodotta minn dan il-metodu ta' skoperta turi l-istess valur massimu fit-Tas kollha (daħla).
Min-naħa l-oħra, it-test ta 'robustezza huwa ħafna aktar tolleranti, u jipproduċi Cqs simili f'firxa wiesgħa ta' Tas, bħal fit-test GFAP muri f'P 6d.
Id-differenza f'Cqs miksuba fl-istess medda ta '8 gradi Celsius hija inqas minn 1, u l-kurva ta' dissoluzzjoni (daħla) tikkonferma l-karatteristiċi ta 'skoperta f'din il-firxa tat-temperatura.Ta 'min jinnota li t-Tas ikkalkulat u l-firxa Ta attwali jistgħu jkunu differenti ħafna.
Hemm ħafna linji gwida mfassla biex jgħinu lir-riċerkaturi jiddisinjaw primers effiċjenti, li ħafna minnhom huma bbażati fuq regoli stabbiliti fit-tul u ingħatat ħafna attenzjoni lit-3′end tal-primers.Ħafna drabi huwa rakkomandat li tinkludi G jew C fit-tarf 3' u żewġ bażijiet G jew C (morsa GC), iżda mhux aktar minn tnejn mill-aħħar 5 bażijiet.
Fil-prattika, dawn ir-regoli jistgħu jiggwidaw lir-riċerkaturi, iżda mhumiex neċessarjament korretti fiċ-ċirkostanzi kollha.
P7 |It-3′end tal-primer għandu ftit effett fuq l-ispeċifiċità jew l-effiċjenza.
A. Il-pożizzjoni tal-primers għall-ġene uman HIF-1α (NM_181054.2).
B. Uża likur omm Agilent Brilliant III SYBR Green (Nru tal-Kat. 600882) biex tkabbar sitt oġġetti tat-test.
C. Grafika ta 'amplifikazzjoni u kurva tat-tidwib irreġistrata mill-istrument CFX qPCR ta' Bio-Rad u primers tat-3′end.L-NTCs huma murija bl-aħmar.
D. Reġistru Cqs ta' kull oġġett tat-test
Pereżempju, ir-riżultat f'P 7 jikkontradixxi r-regola tat-3′tarf.Id-disinni kollha jipproduċu bażikament l-istess riżultati, b'żewġ kombinazzjonijiet tal-primer biss li jwasslu għal amplifikazzjoni mhux speċifika fl-NTC.
Madankollu, ma nistgħux nappoġġjaw l-effett tal-klipp GC, minħabba li f'dan il-każ, l-użu ta 'A jew T bħala massimu ta' 30 bażi ma jnaqqasx l-ispeċifiċità.
It-test C, fejn il-primer F jispiċċa f'GGCC, irreġistra Cqs f'NTCs, li jindika li wieħed jista 'jkun irid jevita dawn is-sekwenzi fit-30-tarf.Aħna nenfasizzaw li l-uniku mod biex tiddetermina l-aħjar sekwenza 3′end ta 'par primer huwa li tevalwa xi primers kandidati b'mod sperimentali.
Effiċjenza ta 'amplifikazzjoni
Importanti, għalkemm is-sejbien mhux speċifiku tal-PCR qatt ma jista 'jsir speċifiku, l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tista' tiġi aġġustata u massimizzata f'ħafna modi differenti billi tinbidel l-enżima, il-likur omm, l-addittivi u l-kundizzjonijiet taċ-ċikliżmu.
Biex tevalwa l-effiċjenza tas-sejbien tal-PCR, huwa aħjar li tuża dilwizzjoni serjali ta '10 jew 5 darbiet l-aċidu nuklejku fil-mira, jiġifieri, il- "metodu tal-kurva standard".
Jekk amplicons PCR jew miri sintetiċi tad-DNA jintużaw biex jiġġeneraw kurva standard, dilwizzjonijiet serjali ta' dawn il-miri għandhom jitħalltu ma' ammont kostanti ta' DNA fl-isfond (bħal DNA ġenomika).
P8 |Kurva tad-dilwizzjoni biex tevalwa l-effiċjenza tal-PCR.
A. Uża primers għal HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA u R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC u Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (numru tal-katalgu 600882) għal PCR u kundizzjonijiet tal-kurva tat-tidwib.
B. 100 ng RNA ġie traskritt b'lura, dilwit 2 darbiet, u kampjuni ta 'cDNA dilwiti serjament ġew dilwiti 5 darbiet għal 1 ng DNA ġenomika umana.Il-kurva tat-tidwib tidher fid-daħla.
C. Ir-reazzjoni RT, dilwizzjoni, u dilwizzjoni serjali ġew ripetuti għat-tieni kampjun ta 'cDNA, u r-riżultati kienu simili.
P 8 juri żewġ kurvi standard, bl-użu tal-istess metodu ta 'skoperta fuq żewġ kampjuni ta' cDNA differenti, ir-riżultat huwa l-istess effiċjenza, madwar 100%, u l-valur R2 huwa wkoll simili, jiġifieri, il-grad ta 'twaħħil bejn id-dejta sperimentali u l-linja ta' rigressjoni jew id-dejta Grad ta 'linearità.
Iż-żewġ kurvi standard huma komparabbli, iżda mhux eżattament l-istess.Jekk l-iskop huwa li tiġi kkwantifikata b'mod preċiż il-mira, għandu jiġi nnutat li mhux aċċettabbli li tiġi pprovduta kalkolu tan-numru tal-kopja mingħajr ma tiġi spjegata l-inċertezza
P9 |Inċertezza tal-kejl assoċjata mal-kwantifikazzjoni bl-użu ta' kurva standard.
A. Uża primers għal GAPDH (NM_002046) biex twettaq PCR u kundizzjonijiet tal-kurva tat-tidwib.F: ACAGTTGCCATGTAGACC u R: TAACTGGTTGAGCACAGG u Mastermix Sensifast SYBR ta' Bioline (numru tal-katalgu BIO-98050).
B. Tabella ta 'amplifikazzjoni, kurva tat-tidwib u kurva standard irreġistrata bl-istrument CFX qPCR ta' Bio-Rad.
C. Grafika tal-kurva standard u intervall ta' kunfidenza ta' 95% (CI).
D. In-numru tal-kopja u l-intervall ta' kunfidenza ta' 95% tat-tliet valuri Cq derivati mill-kurva tad-dilwizzjoni.
P 9 juri li għal test ottimizzat, il-varjabbiltà inerenti ta 'kurva standard waħda hija madwar 2 darbiet (intervall ta' kunfidenza ta '95%, minimu sa massimu), li tista' tkun l-iżgħar varjabbiltà li tista 'tiġi mistennija.
Prodott relatat:
Kit PCR Dirett tat-Tessut tal-Annimali
Ħin tal-post: Settembru-30-2021
