Kulħadd qed jitkellem dwar il-prinċipju tal-esperiment tal-qRT-PCR, id-disinn tal-primer, l-interpretazzjoni tar-riżultati, eċċ., Imma naħseb li għandi naqsam miegħek l-operazzjoni sperimentali tal-qRT-PCR.Huwa żgħir, iżda huwa dwar ir-riżultati.

Qabel ma nagħmlu qRT-PCR, jeħtieġ li jkollna fehim ċar tal-RNA tagħna stess u l-metodi ta 'tħaddim.Wara kollox, l-isforzi tagħna huma mmirati biex jiksbu riżultati, aktar milli sempliċement jipprattikaw.Allura qabel ma nagħmlu qRT-PCR, irridu niddeterminaw il-kwistjonijiet li ġejjin (li wħud minnhom huma applikabbli biss għal SYBR).

1 Int żgur li l-RNA tiegħek mhux degradat?

NanoDrop 2000 jista 'biss jiskopri l-konċentrazzjoni u l-purità tal-RNA, iżda ma jistax jiskopri l-integrità tal-RNA.

Il-valur RNA (RNA Intesity Number) jista 'jirrifletti l-integrità tal-RNA, li hija skoperta mis-sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.

Fig. Dijagramma skematika tal-valuri RIN għal kampjuni ta' RNA differenti (ewkarjoti)

Madankollu, il-laboratorji ġeneralment ma jkollhomx Agilent 2100 Bioanalyzer.F'dan il-każ, nistgħu niskopru permezz tal-ġell tal-formaldehyde, iżda r-rekwiżit għall-ammont totali ta 'RNA huwa għoli, għalhekk l-iktar metodu mgħaġġel huwa li tuża elettroforesi tal-ġel ordinarja.Huwa meħtieġ li jkun f'ambjent mingħajr nukleażi, għalhekk huwa meħtieġ li tlaħlaħ it-tank tal-elettroforeżi, il-flixkun tas-sol, il-parentesi tal-ġel u l-moxt bl-ilma DEPC.L-agarose huwa wkoll ħieles min-nukleażi (sakemm ikun għadu kif infetaħ), u l-Loading Buffer għandu jinfetaħ frisk kemm jista 'jkun, b'1.2% ġel.

Innota li l-ġell għandu jinħall kompletament, inkella jikkawża meded mhux omoġenji, kif muri fil-kampjun 9 fil-figura.Jekk il-vultaġġ ikun għoli wisq jew jaħdem għal żmien twil wisq jiġġenera s-sħana u jikkawża degradazzjoni tal-RNA, għalhekk il-vultaġġ u l-ħin għandhom jiġu kkontrollati b'mod raġonevoli.Barra minn hekk, it-tmexxija tal-ġel tista 'wkoll tiddetermina aktar jekk hemmx residwu tad-DNA fil-kampjun, u josserva jekk hemmx numru kbir ta' meded miżmuma fil-bir tad-distribuzzjoni.

Figura.Sejbien tal-elettroforesi tal-ġel tal-RNA

2 Int ċert dwar il-konċentrazzjoni tas-cDNA tiegħek?

L-esperjenza tal-aħwa l-kbar fil-laboratorju hija li s-cDNA tas-sistema 20 ul miksuba minn kull inverżjoni hija direttament dilwita 20X, filwaqt li l-aħwa post-dottorat huma dilwiti 10X.Normalment niddependi mis-sitwazzjoni.Minħabba li l-kwalità tal-RNA msemmija minn kull persuna hija differenti, il-livell ta 'treġġigħ lura huwa wkoll differenti, u t-teknoloġija tat-treġġigħ lura tista' ma tkunx stabbli.

Allura kull darba li nieħu s-cDNA maqluba, l-ewwel se nħallat madwar 3 darbiet, u mbagħad nuża l-ġene tad-dar biex tagħmel RT-PCR, in-numru ta 'ċikli huwa ġeneralment ta' 25 ċiklu, biex tidentifika l-konċentrazzjoni speċifika, u mbagħad tiddetermina l-fattur ta 'dilwizzjoni finali.

3 Int żgur li l-primers tiegħek huma faċli biex jintużaw?

Jista 'jgħaddi l-kurva tat-tidwib tal-qRT-PCR, iżda dan xorta jiswa l-flus.Għal laboratorji mingħajr ħafna flus, meta jiksbu ħafna primers, jistgħu jużaw RT-PCR ordinarju biex jaraw jekk huwiex faxxa waħda u jidentifikaw l-ispeċifiċità tal-primers.Jekk il-laboratorju ma jkunx qasir ta 'flus, l-ispeċifiċità tal-primers kollha tista' tiġi identifikata darba permezz tal-kurva tat-tidwib.

4 Int ċert li l-kundizzjonijiet sperimentali tiegħek huma adattati?

SYBR għandu jkun protett minn dawl qawwi, għalhekk ipprova itfi d-dawl overhead meta żżid ir-reaġent SYBR, u jeħtieġ biss li tuża dawl baxx biex tlestiha.

Aħżen SYBR f'4°C.Meta tkun qed tuża, aqleb bil-mod 'l fuq u' l isfel biex tħallat sew biex tevita r-ragħwa, u ma vortex b'mod vigoruż.

Xi aħwa iżgħar jixtiequ jpinġu marki fuq il-bord tal-PCR minħabba l-biża' li jħalltu l-kampjuni, li huwa ħażin.Minħabba li l-markers tiegħek x'aktarx li jaffettwaw il-ġbir ta 'sinjali fluworexxenti, ġeneralment nirrakkomanda liż-żgħażagħ biex jużaw notebooks sperimentali biex jgħinu fil-memorja, kif muri hawn taħt.

Figura.Dijagramma tat-tagħbija tal-kampjun qRT-PCR

5 Int żgur li qed tagħmlu sew?

Kun żgur li tilbes ingwanti, tilbes ingwanti, tilbes ingwanti, u tgħid affarijiet importanti tliet darbiet.

Sabiex tnaqqas l-espożizzjoni ta 'SYBR għad-dawl, jien personalment nixtieq inżid mudell l-ewwel, kif muri fil-figura hawn taħt.Skont l-esperjenza, iż-żieda ta 'ammont żgħir ta' mudell x'aktarx li tikkawża żbalji ta 'kampjunar.Għalhekk, sabiex jiġi mminimizzat l-iżball ikkawżat billi żżid ammont żgħir ta 'mudell, normalment nirdoppja mill-ġdid il-kampjun, u nirdoppja l-ammont meta nżid il-kampjun biex inaqqas l-ammont ta' H2O2 miżjud.

Figura.Dijagramma skematika tat-tagħbija qRT-PCR

Imbagħad ikkonfigura s-sistema qRT-PCR kif ġej.

Figura.Dijagramma tal-preparazzjoni tas-sistema qRT-PCR

NOTA: Il-proċess ta 'konfigurazzjoni jeħtieġ li jsir fuq is-silġ.

Wara li żżid il-kampjun, waħħal il-film trasparenti tas-siġillar.Ipprova ma tmissx il-wiċċ tal-film trasparenti tas-siġillar b'idejk, ħaddem biss mill-ispazju fuq iż-żewġ naħat tal-film.Minħabba li l-marki tas-swaba 'jistgħu jaffettwaw ukoll il-ġbir ta' sinjali fluworexxenti.Imbagħad uża ċentrifuga biex tiċċentrifu malajr għal 10 s b'veloċità baxxa biex tevita li l-kampjun jitdendel mal-ħajt.

Prodotti Relatati:

Cell Direct RT-qPCR kit

RT Easy II