Real Time PCR, magħruf ukoll bħala PCR kwantitattiv jew qPCR, huwa metodu għal monitoraġġ u analiżi f'ħin reali ta 'prodotti ta' amplifikazzjoni PCR.
Minħabba li l-PCR kwantitattiv għandu l-vantaġġi ta 'tħaddim sempliċi, veloċi u konvenjenti, sensittività għolja, ripetibbiltà tajba, u rata ta' kontaminazzjoni baxxa, huwa użat ħafna fl-ittestjar mediku, valutazzjoni tal-effikaċja tad-droga, riċerka dwar l-espressjoni tal-ġeni, riċerka transġenika, skoperta tal-ġeni, skoperta ta 'patoġeni, skoperta ta' annimali u pjanti., ittestjar tal-ikel u oqsma oħra.
Għalhekk, kemm jekk inti involut f'riċerka bażika fix-xjenzi tal-ħajja, jew impjegati ta 'kumpaniji farmaċewtiċi, kumpaniji tat-trobbija tal-annimali, kumpaniji tal-ikel, jew saħansitra impjegati ta' spezzjoni ta 'dħul-ħruġ u uffiċċji ta' kwarantina, dipartimenti ta 'monitoraġġ ambjentali, sptarijiet u unitajiet oħra, inti tkun aktar jew inqas espost għal Jew għandek bżonn tkun taf l-għarfien tal-ħakma tal-PCR kwantitattiv.

Prinċipju ta' Real Time PCR

Real Time PCR huwa metodu li fih sustanzi fluworexxenti huma miżjuda mas-sistema ta 'reazzjoni tal-PCR, u l-intensità tas-sinjal tal-fluworexxenza fil-proċess tar-reazzjoni tal-PCR hija mmonitorjata f'ħin reali minn strument PCR kwantitattiv, u finalment id-dejta sperimentali tiġi analizzata u pproċessata.

【Kurva ta' amplifikazzjoni】hija l-kurva li tiddeskrivi l-proċess dinamiku tal-PCR.Il-kurva ta 'amplifikazzjoni tal-PCR mhijiex fil-fatt kurva esponenzjali standard, iżda kurva sigma.

[Fażi tal-pjattaforma tal-kurva tal-amplifikazzjoni]Biż-żieda fin-numru ta 'ċikli PCR, l-inattivazzjoni tad-DNA polimerażi, it-tnaqqis ta' dNTPs u primers, u l-inibizzjoni tar-reazzjoni ta 'sintesi mill-pirofosfat tal-prodott sekondarju tar-reazzjoni, eċċ., Il-PCR mhux dejjem jespandi b'mod esponenzjali., u eventwalment se tidħol fi plateau.

[Reġjun ta' Tkabbir Esponenzjali tal-Kurva ta' Amplifikazzjoni]Għalkemm il-fażi tal-plateau tvarja ħafna, f'ċertu reġjun tar-reġjun tat-tkabbir esponenzjali tal-kurva tal-amplifikazzjoni, ir-ripetibbiltà hija tajba ħafna, li hija importanti ħafna għall-analiżi kwantitattiva tal-PCR.

[Valur tal-limitu u valur Ct]Aħna nissettjaw il-valur tal-limitu ta 'skoperta tal-fluworexxenza fil-pożizzjoni xierqa fiż-żona tat-tkabbir esponenzjali tal-kurva tal-amplifikazzjoni, jiġifieri l-valur tal-limitu (Threshold).L-intersezzjoni tal-valur tal-limitu u l-kurva tal-amplifikazzjoni hija l-valur Ct, jiġifieri, il-valur Ct jirreferi għan-numru ta 'ċikli (Ċiklu tal-Threshold) meta jintlaħaq il-valur tal-limitu.

Il-graff t'hawn taħt turi b'mod ċar ir-relazzjoni bejn il-linja tal-limitu u l-kurva tal-amplifikazzjoni, il-limitu u l-valur Ct.

【Kif tikkwantifika?】

Ġie ppruvat bit-teorija matematika li l-valur Ct għandu relazzjoni lineari inversa mal-logaritmu tan-numru ta 'mudelli inizjali.Real Time PCR tissorvelja prodotti ta 'amplifikazzjoni PCR f'ħin reali u tikkwantifikahom matul il-fażi ta' amplifikazzjoni esponenzjali.

Għal kull ċiklu ta 'PCR, id-DNA żdied b'mod esponenzjali b'2 darbiet, u malajr laħaq plateau.

Jekk wieħed jassumi li l-ammont ta 'DNA tal-bidu huwa A₀ , wara n ċikli, l-ammont teoretiku tal-prodott tad-DNA jista’ jiġi espress bħala:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Imbagħad, aktar ma jkun l-ammont inizjali tad-DNA A 0, aktar ma jkun malajr l-ammont tal-prodott amplifikat jilħaq il-valur ta 'skoperta An , u n-numru ta' ċikli meta jilħaq An huwa l-valur Ct.Jiġifieri, aktar ma jkun l-ammont inizjali tad-DNA A 0, iktar ma jkun kmieni l-qċaċet tal-kurva ta 'amplifikazzjoni, u b'mod korrispondenti n-numru meħtieġ ta' ċikli n huwa iżgħar.

Aħna nwettqu dilwizzjoni tal-gradjent tal-istandard ta 'konċentrazzjoni magħrufa u nużawha bħala mudell għal Real Time PCR, u se tinkiseb serje ta' kurvi ta 'amplifikazzjoni f'intervalli ugwali fl-ordni tal-bidu tal-ammont tad-DNA minn aktar għal inqas.Skont ir-relazzjoni lineari bejn il-valur Ct u l-logaritmu tan-numru ta 'mudelli tal-bidu, a[kurva standard] tista' tinħoloq.

Billi tissostitwixxi l-valur Ct tal-kampjun b'konċentrazzjoni mhux magħrufa fil-kurva standard, jista 'jinkiseb l-ammont inizjali tal-mudell tal-kampjun b'konċentrazzjoni mhux magħrufa, li huwa l-prinċipju kwantitattiv ta' Real Time PCR.

Metodu ta 'skoperta ta' Real Time PCR

Real Time PCR jiskopri prodotti ta 'amplifikazzjoni PCR billi jiskopri l-intensità tal-fluworexxenza fis-sistema ta' reazzjoni.

Prinċipju tal-Metodu ta 'Inkorporazzjoni ta' Żebgħa Fluworexxenti】

Żebgħat fluworexxenti, bħal TB Green ® , jista 'jingħaqad b'mod mhux speċifiku ma' DNA bi stranded doppju f'sistemi PCR u jiffluworexxenti malli jorbot.

L-intensità tal-fluworexxenza fis-sistema ta 'reazzjoni żdiedet b'mod esponenzjali biż-żieda taċ-ċikli tal-PCR.Billi tiskopri l-intensità tal-fluworexxenza, l-ammont ta 'amplifikazzjoni tad-DNA fis-sistema ta' reazzjoni jista 'jiġi mmonitorjat f'ħin reali, u mbagħad l-ammont tal-mudell tal-bidu fil-kampjun jista' jiġi stmat b'mod invers.

【Prinċipju tal-metodu tas-sonda fluworexxenti】

sonda fluworexxentihija sekwenza ta 'aċidu nuklejku bi grupp fluworexxenti fit-tarf 5' u grupp ta' quenching fit-tarf 3', li jista 'jgħaqqad speċifikament mal-mudell.Meta s-sonda tkun intatta, il-fluworexxenza emessa mill-fluworophore titkeffa mill-grupp tat-tifi u ma tistax tifworexxenza.Meta s-sonda tkun dekomposta, is-sustanza fluworexxenti tiddissoċja u temetti fluworexxenza.

Sonda fluworexxenti hija miżjuda mas-soluzzjoni tar-reazzjoni tal-PCR.Matul il-proċess ta 'ttemprar, is-sonda fluworexxenti se torbot mal-pożizzjoni speċifika tal-mudell.Matul il-proċess ta 'estensjoni, l-attività ta' exonuclease 5'→3' ta 'l-enzima PCR tista' tiddekomponi s-sonda fluworexxenti ibridizzata mal-mudell, u s-sustanza fluworexxenti hija dissoċjata biex temetti fluworexxenza.Billi tiskopri l-intensità tal-fluworexxenza tas-sonda fis-sistema ta 'reazzjoni, jista' jintlaħaq l-iskop tal-monitoraġġ tal-ammont ta 'amplifikazzjoni tal-prodott PCR.

【Għażla tal-Metodu ta' Sejbien ta' Fluworexxenza】

Jekk tintuża biex tiddistingwi sekwenzi b'omoloġija għolja u twettaq skoperta ta 'PCR multiplex bħal analiżi tat-tip SNP, il-metodu tas-sonda fluworexxenti huwa insostitwibbli.
Għal esperimenti oħra ta 'PCR Real Time, jista' jintuża metodu ta 'kimera fluworexxenti sempliċi, faċli u bi prezz baxx.

sondiSpeċifiċità qawwija, kapaċi għal PCR multiplex

Nuqqas

Rekwiżiti ta 'speċifiċità għolja għall-amplifikazzjoni;

PCR multiplex ma jistax jiġi performedNeed li jiddisinjaw sondi speċifiċi, spiża għolja;

kultant id-disinn tas-sonda huwa diffiċli

Prodotti Relatati: