Għajnuniet għat-Titjib tal-Irkupru tal-Kolla

1. Żid it-tagħbija tal-kampjun waqt l-elettroforeżi.

2. Uża buffer elettroforeżi ppreparat frisk.

3. Meta taqta 'kolla, ipprova taqta' biss il-kolla bi strixxi biex tnaqqas il-volum tal-qtugħ tal-kolla: m'għandekx bżonn kolla bi ftit frammenti ta 'skop, inkella taffettwa r-rata ta' rkupru.

4. Wara li ddub żewġ biċċiet kolla jew aktar, uża tubu irrispettivament minn kemm hu kbir il-volum u ttrasferih fl-istess kolonna.

5. Is-soluzzjoni miżjuda fis-sol tista 'tkun ftit aktar, li twassal aktar għall-irbit tad-DNA mal-membrana, iżda ġeneralment ma taqbiżx 750ul.

6. Iċ-ċavetta għall-irkupru tal-ġell hija li torbot id-DNA mal-kolonna permezz tal-konċentrazzjoni tal-melħ, l-aċidità (ċarġ) u l-idrofobiċità tas-soluzzjoni fil-kolonna.Għalhekk, jekk il-pH tal-buffer tal-elettroforesi huwa għoli wisq, 10ul (pH 5.0, 3mol/L NaAC) jistgħu jiġu miżjuda mas-sol;sabiex jinterċetta aħjar il-molekuli tad-DNA fuq il-membrana, 30% isopropanol jista 'jiġi miżjud biex jissaħħan fil-likwidu wara li tinħall il-kolla.

7. Qabel ma żżid l-eluwent, ħalli l-kolonna f'temperatura tal-kamra għal ftit minuti (madwar 10 minuti) biex tevapora kompletament l-etanol.

8. Fl-aħħarnett, żid inqas eluwent biex timminimizza l-volum ta 'rkupru.Ġeneralment, 30-50μl eluwent jintuża għall-elużjoni (mhux ftit wisq, inkella ma jkunx jista 'jxarrab il-membrana, li ma jwassalx għal elużjoni);il-qtar tal-eluzzjoni huma fiċ-ċentru tal-membrana, biex elużjoni kompletament id-DNA marbut mal-membrana.

9. Wara li żżid l-eluwent, jista 'jiġi eluwit f'banju ta' l-ilma ta '55 grad għal 5 minuti jew imqiegħed f'banju ta' l-ilma ta '50 grad għal aktar minn 10 minuti, jew issiġillat b'parafilm f'4 gradi matul il-lejl, u mbagħad ċentrifugat għall-irkupru l-għada, l-effett huwa tajjeb.

10.Żid l-eluat ċentrifugat lura fil-kolonna ta 'adsorbiment u ċentrifuga mill-ġdid.

Metodi u proċeduri dettaljati għall-irkupru tal-prodott tal-PCR

1. Riċiklaġġ ordinarju tal-gomma

Jekk trid tirkupra l-kolla, huwa aħjar li tuża kit, li huwa konvenjenti u għandu rata ta 'rkupru kemmxejn ogħla.Jekk verament għandek bżonn tirkupraha manwalment, tista 'żżid 3 darbiet il-volum ta' TE wara li taqta 'l-kolla.Wara li jiddewweb f'banju ta 'l-ilma, il-fenol, il-fenol/kloroform jiġu estratti b'mod nadif, u l-etanol jiġi preċipitat.Dak hu.

2. Irkupru tad-DNA minn ġellijiet b'punt ta 'tidwib baxx

Purifikazzjoni ta 'Frammenti tad-DNA Żid TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8.0, 0.1 mmol/l EDTA) ugwali għall-volum tal-ġell, u poġġi f'banju ta' l-ilma ta' 65°C għal 5 minuti biex tħoll il-ġell kompletament.

Wara li nġiebet għat-temperatura tal-kamra, ġie miżjud ammont ugwali ta 'fenol (saturat b'TE, TE ġie ssiġillat fis-saff ta' fuq, u s-saff t'isfel ta 'fenol tneħħa), u t-taħlita tħallat bil-mod (l-ebda taħlita meħtieġa), u ċentrifugata f'12,000 rpm għal 3 minuti.Irrepeti 1-2 darbiet.

Ħu s-supernatant, żid 0.1 volum ta '3mol/L aċetat tas-sodju (pH 5.2) u 2.5 darbiet volum ta' etanol assolut biex twettaq preċipitazzjoni ta 'l-etanol.Dewweb id-DNA purifikat b'ammont xieraq ta 'TE, kejjel il-kontenut, u pprepara għall-użu (jista' jintuża għall-analiżi tal-istruttura tal-ġeni fil-mira, preparazzjoni tas-sonda, eċċ.).

3. Irkupru tal-PCR b'ispeċifiċità tajba ta 'amplifikazzjoni

Jekk l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni tal-PCR hija tajba, hija biss purifikazzjoni u rkupru sempliċi tal-prodott tal-PCR.Tista 'żżid 50ug/ml proteinase K mal-prodott PCR, 37 grad għal 1h, estratt darba bil-fenol/kloroform, estratt darba bil-kloroform, u żid 0.1 volum tas-supernatant.L-aċetat tas-sodju ġie rkuprat permezz ta 'preċipitazzjoni b'2.5 volumi ta' etanol assolut.

Prodotti relatati:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/