Riċentement, skoprejt xi ħaġa tal-għaġeb!Ħafna professjonisti avvanzati ta 'esperimenti madwaru lanqas biss jafu xi punti ta' għarfien sperimentali bażiċi ħafna.

Pereżempju, tista’ twieġeb il-mistoqsijiet li ġejjin?

Hemm differenza bejn OD260 u A260?Xi jfisser kull wieħed?
OD hija l-abbrevjazzjoni tad-densità ottika (densità ottika), A hija l-abbrevjazzjoni tal-assorbiment (assorbenza), iż-żewġ kunċetti huma fil-fatt l-istess, "densità ottika" hija "assorbenza", iżda "densità ottika" hija konformi mal-biċċa l-kbira tal-istandards nazzjonali u aktar standardizzata.

Normalment aħna nkejlu l-valur OD f'260nm biex nikkalkulaw il-konċentrazzjoni tal-aċidu nuklejku, allura x'jirrappreżenta 1OD?
L-aċidu nuklejku għandu quċċata ta 'assorbiment massimu f'wavelength ta' 260nm, li fih kemm DNA u RNA, kif ukoll frammenti frammentati ta 'aċidu nuklejku (dan huwa l-punt ewlieni).
Il-valur OD imkejjel f'wavelength ta '260 nm ġie rreġistrat bħala OD260.Jekk il-kampjun huwa pur, il-valur OD260 jista 'jikkalkula l-konċentrazzjoni tal-kampjun tal-aċidu nuklejku.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (DNA bi strand doppju)
=37 μg/ml ssDNA (DNA b'linja waħda)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTPs (oligonukleotidi)
Hemm xi konnessjoni u differenza bejn RT-PCR, Realtime-PCR u QPCR?
RT-PCR huwa qasir għal Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, qasira għal Quantitative Real Time PCR
Għalkemm Real Time PCR (PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali) u Reverse Transcription PCR (reverse trascription PCR) it-tnejn jidhru li huma mqassra bħala RT-PCR.Iżda l-konvenzjoni internazzjonali hija: RT-PCR tirreferi speċifikament għal PCR ta 'traskrizzjoni inversa.

X'inhuma l-nt, bp, u kb użati b'mod komuni biex jiddeskrivu t-tul tad-DNA/RNA fil-bijoloġija?
nt = nukleotide
bp = par bażi par bażi
kb = kilobase

Ovvjament, tgħid li ħafna nies ma jimpurtahomx minn dawn id-dettalji żgħar!Kulħadd jagħmel dan, u ħadd ma jistaqsik x’inhu.Taf li dan mhux meħtieġ, hux?

Le, Le, Le, huwa ferm meħtieġ li tkun taf dan!minħabba liema?
Għax trid tpoġġi artiklu!Brother!Kemm jekk qed timmira għall-gradwazzjoni jew issegwi kisbiet tar-riċerka xjentifika, trid tistrieħ fuq artikli biex titkellem!

L-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku għandha tkun l-aktar esperiment sempliċi u bażiku.Il-kwalità tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku tiddetermina direttament ir-riżultati tal-esperimenti sussegwenti.

Għalkemm għedtha ħafna drabi, għad hemm ħafna ħbieb li ma jimpurtahomx.Din id-darba ddeċidejt li noħroġ mill-artiklu!

Informazzjoni Minima għall-Pubblikazzjoni ta' Esperimenti Kwantitattivi ta' PCR f'Ħin Real, imsejħa MIQE, huwa sett ta 'linji gwida ta' esperimenti kwantitattivi ta 'fluworexxenza mnedija internazzjonalment, li jipproponi standards minimi għall-informazzjoni sperimentali meħtieġa għall-evalwazzjoni ta' esperimenti ta 'PCR kwantitattivi ta' fluworexxenza u l-pubblikazzjoni ta 'artikoli.Permezz tal-kundizzjonijiet sperimentali u l-metodi ta 'analiżi pprovduti mill-esperimentatur, ir-reviżuri jistgħu jevalwaw aħjar il-validità tal-iskema sperimentali tar-riċerkatur.

Wieħed jista 'jara li fit-taqsima tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, ġew proposti l-oġġetti ta' skoperta li ġejjin,

“E” tindika informazzjoni li trid tiġi pprovduta u “D” tindika informazzjoni li għandha tingħata jekk meħtieġ.

Il-forma hija kkumplikata ħafna, fil-fatt, irrid ngħid li kulħadd jeħtieġ li jibda minn

purità (D), rendiment (D), integrità (E) u konsistenza (E) biex jiġu evalwati l-aċidi Nukleiċi f'dawn l-erba 'aspetti.

Skond drawwiet sperimentali, l-ewwel tkellem dwar il-metodi ta 'evalwazzjoni ta' purità u konċentrazzjoni.

Il-kejl OD huwa l-metodu ta 'skoperta favorit u eħfef għall-esperimentaturi.Fir-rigward tal-prinċipju, jien mhux se nidħol fid-dettalji hawn.Ħafna laboratorji issa jużaw spettrofotometri ultra-mikro biex janalizzaw direttament kwantitattivament kampjuni ta 'aċidu nuklejku.Waqt li juri l-valur tal-assorbiment, il-programm jagħti direttament il-valur tal-konċentrazzjoni (aċidu nuklejku, proteina u żebgħa fluworexxenti) u proporzjonijiet relatati.Fir-rigward tal-analiżi tal-valur OD, Issejvja din l-istampa u tkun tajjeb.

Lista ta 'soluzzjonijiet ta' valur OD universali

Madankollu, hemm ftit twissijiet li jeħtieġ li jinħarġu separatament għalik.

(Wara kollox, naf li inti trid tkun dawk li jiffrankaw u stennew sakemm ikollok bżonnhom!)

Nota 1 Tagħmir

Il-valur OD se jkun affettwat minn tagħmir differenti.Sakemm l-OD260 ikun f'ċerta medda, il-valuri ta 'OD230 u OD280 huma sinifikanti.Pereżempju, il-firxa ta 'assorbiment tal-Eppendorf D30 komuni f'260nm hija 0 ~ 3A, u n-NanoDrop One ta' Thermo hija f'260nm.Il-firxa ta 'assorbiment ta' 0.5 ~ 62.5A.

Nota 2Reaġent tad-dilwizzjoni

Il-valur OD jista 'jiġi affettwat mid-dilwizzjoni ta' reaġenti differenti.Per eżempju, il-qari OD260/280 ta 'RNA purifikat fil-pH7.5 10mM Trisbuffer huwa bejn 1.9-2.1, filwaqt li fisoluzzjoni milwiema newtraliil-proporzjon se jkun aktar baxx, forsi biss 1.8-2.0, iżda dan ma jfissirx li l-kwalità tal-RNA tinbidel Differenza.

Nota 3Sustanzi residwi

L-eżistenza ta 'sustanzi residwi se taffettwa l-eżattezza tal-kejl tal-konċentrazzjoni tal-aċidu nuklejku, għalhekk huwa meħtieġ li jiġu evitati residwi ta' proteini, fenol, polysaccharide u polyphenol f'kampjuni ta 'aċidu nuklejku kemm jista' jkun.

Madankollu, fil-fatt, l-estrazzjoni b'reaġenti organiċi hija metodu antik.F'kits kummerċjali, l-effett ta 'estrazzjoni jista' jinkiseb permezz ta 'kolonna ta' adsorbiment ibbażata fuq is-silika flimkien ma 'ċentrifugazzjoni, tevita reaġenti organiċi tossiċi u ta' ħsara li huma diffiċli biex jitneħħew, eċċ Il-problema, bħalma humaKit ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku ta 'Foregene, ma jużax DNase/RNase u reaġenti organiċi tossiċi matul l-operazzjoni, veloċi u sigur, u ileffett huwatajba(aċċidentalment qal li kien qargħi, imma naf li trid tkun taf).

Eżempju 1: Rendiment u purità tal-estrazzjoni tad-DNA ġenomika

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) jittratta kampjuni tal-ħamrija minn diversi sorsi, u l-ammont u l-purità tad-DNA ġenomika miksuba huma murija fit-tabella li ġejja:
Eżempju 2: Rendiment u purità tal-estrazzjoni tal-RNA tat-tessut

Il-Kit ta' Iżolament ta' l-RNA Totali ta' l-Annimali (RE-03012) ipproċessa diversi kampjuni tat-tessuti, u l-ammont u l-purità ta' RNA miksuba huma murija fit-tabella hawn taħt (għal tessut tal-ġrieden):
Madankollu, taħsibx li inti lest bil-valur OD.Għandek xi tieħu ħsieb il-punti ewlenin li ġibtlek fuq quddiem?

Avviż

Molekuli ta 'aċidu nuklejku frammentati se jiġu kkalkulati wkoll fl-assorbiment.Jekk wieħed jassumi li għandek residwi tad-DNA ġenomika fl-RNA, il-valur OD tiegħek jidher li huwa għoli ħafna, iżda l-konċentrazzjoni attwali tal-RNA ma tistax tiġi determinata.Jekk l-RNA tiegħek huwiex Mhuwiex ċar jekk hemmx degradazzjoni, għalhekk għad għandna bżonn metodu ta 'evalwazzjoni komprensiv biex nagħtu ġudizzju aktar preċiż, jiġifieri, l-evalwazzjoni tal-integrità tal-aċidu nuklejku msemmija f'MIQE.