1. Għarfien bażiku (jekk trid tara l-parti sperimentali, jekk jogħġbok ittrasferixxi direttament għat-tieni parti)
Bħala reazzjoni derivattiva ta 'PCR konvenzjonali, PCR f'ħin reali jissorvelja prinċipalment il-bidla tal-ammont ta' prodott ta 'amplifikazzjoni f'kull ċiklu tar-reazzjoni ta' amplifikazzjoni tal-PCR f'ħin reali permezz tal-bidla tas-sinjal tal-fluworexxenza, u janalizza kwantitattivament il-mudell tal-bidu permezz tar-relazzjoni bejn il-valur ct u l-kurva standard .
Id-dejta speċifika ta 'RT-PCR humalinja bażi, limitu tal-fluworexxenzauValur Ct.
| linja bażi: | Il-valur tal-fluworexxenza taċ-ċiklu 3-15 huwa l-linja bażi (linja bażi), li hija kkawżata mill-iżball okkażjonali tal-kejl. |
| Limitu (limitu): | Jirreferi għal-limitu ta 'skoperta ta' fluworexxenza stabbilit f'pożizzjoni xierqa fir-reġjun tat-tkabbir esponenzjali tal-kurva ta 'amplifikazzjoni, ġeneralment 10 darbiet id-devjazzjoni standard tal-linja bażi. |
| Valur CT: | Huwa n-numru ta 'ċikli PCR meta l-valur tal-fluworexxenza f'kull tubu ta' reazzjoni jilħaq il-limitu. Il-valur Ct huwa inversament proporzjonali għall-ammont tal-mudell inizjali. |
Metodi ta' tikkettar komuni għall-RT-PCR:
| metodu | vantaġġ | nuqqas | ambitu ta' applikazzjoni |
| SYBR GreenⅠ | Applikabilità wiesgħa, sensittiva, irħisa u konvenjenti | Ir-rekwiżiti tal-primer huma għoljin, suxxettibbli għal meded mhux speċifiċi | Huwa adattat għal analiżi kwantitattiva ta 'diversi ġeni fil-mira, riċerka dwar l-espressjoni tal-ġeni, u riċerka dwar annimali u pjanti rikombinanti transġeniċi. |
| TaqMan | Speċifiċità tajba u ripetibbiltà għolja | Il-prezz huwa għoli u adattat biss għal għanijiet speċifiċi. | Sejbien tal-patoġenu, riċerka tal-ġeni tar-reżistenza tad-droga, valutazzjoni tal-effikaċja tad-droga, dijanjosi ta 'mard ġenetiku. |
| xempju molekulari | Speċifiċità għolja, fluworexxenza, sfond baxx | Il-prezz huwa għoli, huwa adattat biss għal skop speċifiku, id-disinn huwa diffiċli, u l-prezz huwa għoli. | Analiżi speċifika tal-ġeni, analiżi SNP |
2. Passi sperimentali
2.1 Dwar il-grupp sperimentali- għandu jkun hemm bjar multipli fil-grupp, u għandu jkun hemm repetizzjonijiet bijoloġiċi.
| ① | Kontroll vojt | Użat biex jiskopri l-istatus tat-tkabbir taċ-ċelluli fl-esperimenti |
| ② | SiRNA ta' kontroll negattiv (sekwenza ta' siRNA mhux speċifika) | Uri l-ispeċifiċità tal-azzjoni RNAi.siRNA jista' jinduċi rispons ta' stress mhux speċifiku f'konċentrazzjoni ta' 200nM. |
| ③ | Kontroll tar-Reaġent tat-Trasfezzjoni | Eskludi t-tossiċità tar-reaġent tat-trasfezzjoni għaċ-ċelloli jew l-effett fuq l-espressjoni tal-ġene fil-mira |
| ④ | siRNA kontra ġene fil-mira | Knock down l-espressjoni tal-ġene fil-mira |
| ⑤ (mhux obbligatorju) | siRNA pożittiv | Użat biex issolvi l-problemi tas-sistema sperimentali u l-problemi operattivi |
| ⑥ (mhux obbligatorju) | Kontroll fluworexxenti siRNA | L-effiċjenza tat-trasfezzjoni taċ-ċelluli tista 'tiġi osservata b'mikroskopju |
2.2 Prinċipji tad-disinn tal-primer
| Daqs tal-framment amplifikat | Preferibbilment f'100-150bp |
| Primer Tul | 18-25bp |
| Kontenut GC | 30% -70%, preferibbilment 45% -55% |
| Valur Tm | 58-60℃ |
| Sekwenza | Evita T/C kontinwu;A/G kontinwu |
| 3 sekwenza tat-tmiem | Evita GC sinjuri jew AT sinjuri;il-bażi terminali hija preferibbilment G jew C;huwa aħjar li tevita T |
| Kumplimentarjetà | Evita sekwenzi komplementari ta' aktar minn 3 bażijiet fi ħdan il-primer jew bejn żewġ primers |
| Speċifiċità | Uża blast search biex tikkonferma l-ispeċifiċità tal-primer |
①SiRNA hija speċifika għall-ispeċi, u s-sekwenzi ta 'speċi differenti se jkunu differenti.
②SiRNA huwa ppakkjat fi trab imnixxef bil-friża, li jista 'jinħażen b'mod stabbli għal 2-4 ġimgħat f'temperatura tal-kamra.
2.3 Għodod jew reaġenti li jeħtieġ li jiġu ppreparati minn qabel
| Primer (referenza interna) | Inkluż quddiem u lura tnejn |
| Primers (ġene fil-mira) | Inkluż quddiem u lura tnejn |
| Target Si RNA (3 strixxi) | Ġeneralment, il-kumpanija se sintetizza 3 strixxi, u mbagħad tagħżel waħda mit-tlieta permezz ta 'RT-PCR |
| Kit ta' Trasfezzjoni | Lipo2000 eċċ. |
| Kit ta' Estrazzjoni Rapida RNA | Għall-estrazzjoni tal-RNA wara t-trasfezzjoni |
| Kit ta' Traskrizzjoni Rapida Reverse | għas-sintesi ta' cDNA |
| Kit ta' Amplifikazzjoni tal-PCR | 2×Super SYBR Green QPCR Master Mix |
2.4 Rigward il-kwistjonijiet li jeħtieġ li tingħata attenzjoni għalihom fil-passi sperimentali speċifiċi:
①proċess ta 'trasfezzjoni siRNA
1. Għall-kisi, tista 'tagħżel pjanċa ta' 24 bir, pjanċa ta '12-il bir jew pjanċa 6-well (il-konċentrazzjoni medja ta' RNA proposta f'kull bir ta 'pjanċa ta' 24 bir hija ta 'madwar 100-300 ng / uL), u l-aħjar densità ta' trasfezzjoni taċ-ċelloli hija sa 60% -80% jew hekk
2. Il-passi tat-trasfezzjoni u r-rekwiżiti speċifiċi huma strettament skont l-istruzzjonijiet.
3. Wara t-trasfezzjoni, il-kampjuni jistgħu jinġabru fi żmien 24-72 siegħa għal skoperta ta 'mRNA (RT-PCR) jew skoperta ta' proteini fi żmien 48-96 siegħa (WB)
② proċess ta 'estrazzjoni RNA
1. Prevenzjoni tal-kontaminazzjoni minn enzimi eżoġeni.Dan jinkludi prinċipalment liebes maskri u ingwanti strettament;bl-użu ta 'ponot ta' pipetti sterilizzati u tubi EP;l-ilma użat fl-esperiment għandu jkun Ħieles mill-RNase.
2. Huwa rakkomandat li tagħmel darbtejn kif issuġġerit fil-kit ta 'estrazzjoni ta' malajr, li verament itejjeb il-purità u r-rendiment.
3. Il-likwidu tal-iskart m'għandux imiss mal-kolonna tal-RNA.
③ Kwantifikazzjoni tal-RNA
Wara li l-RNA jiġi estratt, jista 'jiġi kkwantifikat direttament b'Nanodrop, u l-qari minimu jista' jkun baxx daqs 10ng/ul.
④Proċess ta 'traskrizzjoni inversa
1. Minħabba s-sensittività għolja ta 'RT-qPCR, għandhom isiru mill-inqas 3 bjar paralleli għal kull kampjun biex jipprevjenu li s-Ct sussegwenti ma jkunx wisq differenti jew li l-SD ikun kbir wisq għal analiżi statistika.
2. Tiffriżax u tinħallx it-taħlita Master ripetutament.
3. Kull tubu/toqba għandu jiġi sostitwit b'ponta ġdida!Tużax kontinwament l-istess ponta tal-pipetta biex iżżid kampjuni!
4. Il-film imwaħħal mal-pjanċa ta '96-bir wara li żżid il-kampjun jeħtieġ li jittaffa bi pjanċa.L-aħjar huwa li tiċċentrifuga qabel ma tpoġġiha fuq il-magna, sabiex il-likwidu fuq il-ħajt tat-tubu jkun jista 'jiċċirkola 'l isfel u neħħi l-bżieżaq tal-arja.
⑤Analiżi tal-kurva komuni
| L-ebda perjodu ta 'tkabbir logaritmiku | Possibbilment konċentrazzjoni għolja ta 'mudell |
| L-ebda valur CT | Passi mhux korretti għall-iskoperta ta' sinjali fluworexxenti; degradazzjoni ta 'primers jew sondi - l-integrità tagħha tista' tiġi skoperta permezz ta 'elettroforeżi PAGE; ammont insuffiċjenti ta' mudell; degradazzjoni ta' mudelli – tiġi evitata l-introduzzjoni ta' impuritajiet u iffriżar u tidwib ripetut fil-preparazzjoni tal-kampjuni; |
| Ct>38 | Effiċjenza baxxa ta 'amplifikazzjoni;Il-prodott tal-PCR huwa twil wisq;diversi komponenti ta 'reazzjoni huma degradati |
| Kurva ta' amplifikazzjoni lineari | Is-sondi jistgħu jiġu parzjalment degradati b'ċikli ripetuti ta' ffriżar-tidwib jew espożizzjoni fit-tul għad-dawl |
| Id-differenza fit-toqob duplikati hija partikolarment kbira | Is-soluzzjoni ta 'reazzjoni mhix imdewba kompletament jew is-soluzzjoni ta' reazzjoni mhix imħallta;il-banju termali tal-istrument tal-PCR huwa kkontaminat minn sustanzi fluworexxenti |
2.5 Dwar l-analiżi tad-dejta
L-analiżi tad-dejta tal-qPCR tista 'tinqasam fi kwantifikazzjoni relattiva u kwantifikazzjoni assoluta.Per eżempju, ċelloli fil-grupp ta 'trattament meta mqabbla ma' ċelloli fil-grupp ta 'kontroll,
Kemm-il darba l-mRNA tal-ġene X jinbidel, din hija kwantifikazzjoni relattiva;f'ċertu numru ta 'ċelluli, l-mRNA tal-ġene X
Kemm hemm kopji, din hija kwantifikazzjoni assoluta.Normalment dak li nużaw l-aktar fil-laboratorju huwa l-metodu kwantitattiv relattiv.Normalment,il-metodu 2-ΔΔctjintuża l-aktar fl-esperimenti , għalhekk dan il-metodu biss se jiġi introdott fid-dettall hawn.
Metodu 2-ΔΔct: Ir-riżultat miksub huwa d-differenza fl-espressjoni tal-ġene fil-mira fil-grupp sperimentali relattiv għall-ġene fil-mira fil-grupp ta 'kontroll.Huwa meħtieġ li l-effiċjenzi ta 'amplifikazzjoni kemm tal-ġene fil-mira kif ukoll tal-ġene ta' referenza interna jkunu qrib il-100%, u d-devjazzjoni relattiva m'għandhiex taqbeż il-5%.
Il-metodu tal-kalkolu huwa kif ġej:
Δct grupp ta’ kontroll = valur ct tal-ġene fil-mira fil-grupp ta’ kontroll – valur ct tal-ġene ta’ referenza interna fil-grupp ta’ kontroll
Δct grupp sperimentali = valur ct tal-ġene fil-mira fil-grupp sperimentali – valur ct tal-ġene ta 'referenza interna fil-grupp sperimentali
ΔΔct=Δct grupp sperimentali-Δct grupp ta 'kontroll
Fl-aħħarnett, ikkalkula l-multiplu tad-differenza fil-livell tal-espressjoni:
Bidla Itwi = 2-ΔΔct (li tikkorrispondi mal-funzjoni Excel hija POWER)
Prodotti relatati:
Ħin tal-post: Mejju-20-2023
