一、Iżżid is-sensittività tas-sistema ta 'reazzjoni:

1. Iżola RNA ta 'kwalità għolja:

Sintesi ta 'cDNA b'suċċess ġejja minn RNA ta' kwalità għolja.RNA ta 'kwalità għolja għandu mill-inqas ikun fit-tul sħiħ u ħieles minn inibituri ta' reverse transcriptase bħal EDTA jew SDS.Il-kwalità tal-RNA tiddetermina l-ammont massimu ta 'informazzjoni tas-sekwenza li tista' tittraskrivi f'cDNA.Metodu ta 'purifikazzjoni ta' RNA komuni huwa metodu ta 'pass wieħed li juża guanidine isothiocyanate/acid phenol.Biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni minn traċċi ta 'RNase, RNA iżolat minn kampjuni b'ħafna RNase (bħal frixa) jeħtieġ li jinħażen fil-formaldehyde biex jippreserva RNA ta' kwalità għolja, speċjalment għal ħażna fit-tul.L-RNA estratt mill-fwied tal-far kien bażikament degradat wara li nħażen fl-ilma għal ġimgħa, filwaqt li l-RNA estratt mill-milsa tal-firien baqa 'stabbli wara li nħażen fl-ilma għal 3 snin.Barra minn hekk, traskrizzjonijiet itwal minn 4 kb huma aktar sensittivi għad-degradazzjoni minn traċċi RNases minn traskrizzjonijiet żgħar.Biex tiżdied l-istabbiltà ta 'kampjuni ta' RNA maħżuna, RNA jista 'jiġi maħlul f'formamide dejonizzat u maħżun f'-70 °C.Formamide użata biex tippreserva l-RNA għandha tkun ħielsa minn debris li jiddegrada l-RNA.L-RNA mill-frixa jista 'jiġi ppreservat f'formamide għal mill-inqas sena.Meta tkun qed tipprepara biex tuża RNA, tista 'tuża l-metodu li ġej biex tippreċipita l-RNA: żid NaCl għal 0.2M u 4 darbiet il-volum ta' etanol, poġġi f'temperatura tal-kamra għal 3-5 minuti, u ċentrifuga f'10,000 × g għal 5 minuti.

2. Uża l-RNaseH-inattiv (RNaseH-) reverse transcriptase:

Inibituri ta 'RNase huma spiss miżjuda għal reazzjonijiet ta' traskrizzjoni inversa biex iżidu t-tul u r-rendiment tas-sintesi ta 'cDNA.L-inibituri ta 'RNase għandhom jiżdiedu matul ir-reazzjoni ta' sinteżi ta 'l-ewwel fergħa fil-preżenza ta' buffer u aġent li jnaqqas (bħal DTT), minħabba li l-proċess qabel is-sintesi ta 'cDNA jiddenatura l-inibitur, u b'hekk jirrilaxxa RNase marbut li jista' jiddegrada l-RNA.L-inibituri tal-protein RNase jipprevjenu biss id-degradazzjoni tal-RNA minn RNase A, B, C, u ma jipprevjenux RNase fuq il-ġilda, għalhekk oqgħod attent li ma tintroduċix RNase minn subgħajk minkejja l-użu ta 'dawn l-inibituri.

Reverse transcriptase jikkatalizza l-konverżjoni ta 'RNA għal cDNA.Kemm M-MLV kif ukoll AMV għandhom attività RNaseH endoġena minbarra l-attività tal-polimerażi tagħhom stess.L-attività RNaseH u l-attività tal-polimerażi jikkompetu ma 'xulxin għall-linja ibrida ffurmata bejn il-mudell tal-RNA u l-faxxa tal-estensjoni tad-DNA primer jew cDNA, u jiddegradaw il-fergħa tal-RNA fil-kumpless RNA:DNA.Il-mudell RNA degradat mill-attività RNaseH ma jistax iservi aktar bħala sottostrat effettiv għas-sintesi ta 'cDNA, li jnaqqas ir-rendiment u t-tul tas-sintesi ta' cDNA.Għalhekk, ikun ta 'benefiċċju li tiġi eliminata jew titnaqqas ħafna l-attività RNaseH ta' reverse transcriptase.。

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase u thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, jistgħu jiksbu aktar ammont u aktar cDNA full-length minn MMLV u AMV.Is-sensittività RT-PCR se tkun affettwata mill-ammont ta 'sintesi ta' cDNA.ThermoScript huwa ħafna aktar sensittiv minn AMV.Id-daqs tal-prodotti RT-PCR huwa limitat mill-kapaċità tar-reverse transcriptase li jissintetizza cDNA, speċjalment meta tikklona cDNAs akbar.Meta mqabbel ma 'MMLV, SuperScripⅡ żied b'mod sinifikanti r-rendiment ta' prodotti RT-PCR twal.L-RNaseH-reverse transcriptase wkoll żdied termostabbiltà, sabiex ir-reazzjoni tista 'titwettaq f'temperaturi ogħla min-normali 37-42 ° C.Taħt il-kundizzjonijiet ta 'sintesi suġġeriti, uża primer oligo(dT) u 10 μCi ta' [α-P]dCTP.Ir-rendiment totali ta 'l-ewwel linja ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu ta' preċipitazzjoni TCA.CDNA tul sħiħ ġie analizzat bl-użu ta 'meded magħżula skond id-daqs imqattgħin u magħduda fuq ġel agarose alkalin.

3. Għolli t-temperatura ta 'inkubazzjoni għat-traskrizzjoni inversa:

Temperatura ta 'inkubazzjoni ogħla tgħin biex tiftaħ l-istruttura sekondarja ta' l-RNA, u żżid ir-rendiment tar-reazzjoni.Għall-biċċa l-kbira tal-mudelli tal-RNA, l-inkubazzjoni tal-RNA u l-primers f'65 ° C mingħajr buffer jew melħ, segwit minn tkessiħ rapidu fuq is-silġ se telimina l-biċċa l-kbira tal-istrutturi sekondarji u tippermetti li l-primers jorbtu.Madankollu, xi mudelli għad għandhom strutturi sekondarji, anke wara denaturazzjoni tas-sħana.L-amplifikazzjoni ta 'dawn il-mudelli diffiċli tista' ssir bl-użu ta 'ThermoScript Reverse Transcriptase u t-tqegħid tar-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa f'temperatura ogħla biex tittejjeb l-amplifikazzjoni.Temperaturi ogħla ta 'inkubazzjoni jistgħu wkoll iżidu l-ispeċifiċità, speċjalment meta primers speċifiċi għall-ġeni (GSP) jintużaw għas-sintesi ta' cDNA (ara l-Kapitolu 3).Jekk tuża GSP, kun żgur li t-Tm tal-primers huwa l-istess bħat-temperatura ta' inkubazzjoni mistennija.Tużax oligo(dT) u primers każwali 'l fuq minn 60°C.Primers każwali jeħtieġu inkubazzjoni f'25°C għal 10 minuti qabel ma jiżdiedu għal 60°C.Minbarra l-użu ta 'temperatura ogħla ta' traskrizzjoni inversa, l-ispeċifiċità tista 'titjieb ukoll billi t-taħlita ta' RNA/primer tittrasferixxi direttament mit-temperatura ta 'denaturazzjoni ta' 65 ° C għat-temperatura ta 'inkubazzjoni ta' traskrizzjoni inversa u żżid taħlita ta 'reazzjoni 2× msaħħna minn qabel (sintesi hot-start cDNA) .Dan l-approċċ jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi intermolekulari li jseħħ f'temperaturi aktar baxxi.Il-bdil tat-temperatura multiplu meħtieġ għal RT-PCR jista 'jiġi ssimplifikat bl-użu ta' ċiklatur termali.

Tth polimerażi termostabbli taġixxi bħala polimerażi tad-DNA fil-preżenza ta 'Mg2+ u bħala polimerażi RNA fil-preżenza ta' Mn2+.Jista 'jinżamm sħun f'temperatura massima ta' 65°C.Madankollu, il-preżenza ta 'Mn2 + waqt PCR tnaqqas il-fedeltà, li tagħmel Tth polymerase inqas adattata għal amplifikazzjoni ta' preċiżjoni għolja, bħall-klonazzjoni ta 'cDNA.Barra minn hekk, Tth għandu effiċjenza baxxa ta 'traskrizzjoni inversa, li tnaqqas is-sensittività, u, peress li t-traskrizzjoni inversa u l-PCR jistgħu jitwettqu b'enzima waħda, reazzjonijiet ta' kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa ma jistgħux jintużaw biex iqabblu prodotti ta 'amplifikazzjoni cDNA b'DNA ġenomika li tikkontamina.Il-prodotti ta 'amplifikazzjoni ġew separati.

4. Addittivi li jippromwovu traskrizzjoni inversa:

Addittivi inklużi gliċerol u DMSO huma miżjuda mar-reazzjoni ta 'sinteżi ta' l-ewwel fergħa, li tista 'tnaqqas l-istabbiltà tal-linja doppja ta' l-aċidu nuklejku u tħoll l-istruttura sekondarja ta 'RNA.Sa 20% gliċerol jew 10% DMSO jistgħu jiġu miżjuda mingħajr ma tiġi affettwata l-attività SuperScript II jew MMLV.AMV jista 'wkoll jittollera sa 20% gliċerol mingħajr telf ta' attività.Sabiex timmassimizza s-sensittività ta 'RT-PCR fir-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa SuperScriptⅡ, 10% gliċerol jista 'jiġi miżjud u inkubat f'45 ° C.Jekk 1/10 tal-prodott ta 'reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa huwa miżjud mal-PCR, allura l-konċentrazzjoni tal-gliċerol fir-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni hija 0.4%, li mhix biżżejjed biex tinibixxi l-PCR.

5. RNaseH kura:

It-trattament ta' reazzjonijiet ta' sintesi ta' cDNA b'RNaseH qabel PCR jista' jżid is-sensittività.Għal xi mudelli, huwa maħsub li l-RNA fir-reazzjoni ta 'sintesi ta' cDNA jipprevjeni l-irbit ta 'prodotti ta' amplifikazzjoni, f'liema każ it-trattament RNaseH jista 'jżid is-sensittività.Ġeneralment, it-trattament ta 'RNaseH huwa meħtieġ meta jamplifika mudelli ta' mira ta 'cDNA ta' tul sħiħ itwal, bħal scherożi tuberuża II b'kopja baxxa.Għal dan il-mudell diffiċli, it-trattament RNaseH saħħaħ is-sinjal prodott minn SuperScript II jew cDNA sintetizzat bl-AMV.Għall-biċċa l-kbira tar-reazzjonijiet RT-PCR, it-trattament RNaseH huwa fakultattiv, minħabba li l-pass ta 'denaturazzjoni tal-PCR f'95 ° C ġeneralment idrolizza l-RNA fil-kumpless RNA:DNA.

6. Titjib tal-Metodu ta 'Sejbien ta' RNA Żgħar:

RT-PCR huwa ta 'sfida speċjalment meta ammonti żgħar biss ta' RNA huma disponibbli.Il-glikoġenu miżjud bħala trasportatur waqt l-iżolament tal-RNA jgħin biex iżid ir-rendiment ta 'kampjuni żgħar.Glycogen ħieles minn RNase jista 'jiġi miżjud fl-istess ħin maż-żieda ta' Trizol.Il-glikoġenu jinħall fl-ilma u jista 'jinżamm fil-fażi milwiema b'RNA biex jgħin il-preċipitazzjoni sussegwenti.Għal kampjuni ta' inqas minn 50 mg ta' tessut jew 106 ċelluli kkultivati, il-konċentrazzjoni rakkomandata ta' glycogen ħieles minn RNase hija 250 μg/ml.

Iż-żieda ta 'BSA acetylated mar-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa bl-użu ta 'SuperScript II tista' żżid is-sensittività, u għal ammonti żgħar ta 'RNA, tnaqqas l-ammont ta' SuperScript II u żżid 40 unità ta 'inibitur tan-nukleażi RNaseOut tista' żżid il-livell ta 'skoperta.Jekk jintuża glycogen fil-proċess ta 'iżolament ta' l-RNA, xorta huwa rakkomandat li żżid BSA jew inibitur ta 'RNase meta tuża SuperScript II għal reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa.

二、Iżżid l-ispeċifiċità RT-PCR

1. CND Asintesi:

Is-sinteżi tal-cDNA tal-ewwel linja tista 'tibda bl-użu ta' tliet metodi differenti, li l-ispeċifiċità relattiva tagħhom taffettwa l-ammont u t-tip ta 'cDNA sintetizzat.

Il-metodu primer każwali kien l-inqas speċifiku mit-tliet metodi.Primers jannaw f'siti multipli matul it-traskrizzjoni, u jiġġeneraw cDNAs qosra ta' tul parzjali.Dan il-metodu huwa spiss użat biex jinkisbu sekwenzi tat-tarf 5′ u biex jinkiseb cDNA minn mudelli ta 'RNA b'reġjuni ta' struttura sekondarja jew b'siti ta 'terminazzjoni li ma jistgħux jiġu replikati permezz ta' reverse transcriptase.Biex tikseb l-itwal cDNA, il-proporzjon ta 'primers għal RNA f'kull kampjun ta' RNA jeħtieġ li jiġi determinat empirikament.Il-konċentrazzjoni tal-bidu ta 'primers każwali varjat minn 50 sa 250 ng għal kull reazzjoni ta' 20 μl.Peress li cDNA sintetizzat minn RNA totali bl-użu ta 'primers każwali huwa primarjament RNA ribosomali, poly(A)+RNA ġeneralment jintgħażel bħala l-mudell.

Primers Oligo(dT) huma aktar speċifiċi minn primers każwali.Jibridizza mad-denb poly(A) li jinsab fit-tarf 3′ tal-biċċa l-kbira tal-mRNAs ewkarjotiċi.Minħabba li l-poly(A)+ RNA huwa bejn wieħed u ieħor 1% sa 2% tal-RNA totali, l-ammont u l-kumplessità ta 'cDNA huma ħafna inqas milli bi primers każwali.Minħabba l-ispeċifiċità għolja tiegħu, oligo(dT) ġeneralment ma jeħtieġx ottimizzazzjoni tal-proporzjon ta 'RNA għal primers u għażla poly(A)+.Huwa rakkomandat li tuża 0.5μg oligo(dT) għal kull sistema ta 'reazzjoni ta' 20μl.oligo (dT) 12-18 huwa adattat għal ħafna RT-PCR.Is-Sistema ThermoScript RT-PCR toffri oligo(dT)20 minħabba l-istabbiltà termali aħjar tagħha għal temperaturi ogħla ta 'inkubazzjoni.

Gene specific primers (GSP) huma l-aktar primers speċifiċi għall-pass tat-traskrizzjoni inversa.GSP huwa oligonukleotide antisens li jista' speċifikament ibridizza mas-sekwenza fil-mira tal-RNA, b'differenza minn primers każwali jew oligo(dT), li janneal mal-RNAs kollha.L-istess regoli użati għad-disinn ta' primers tal-PCR japplikaw għad-disinn tal-GSP f'reazzjonijiet ta' traskrizzjoni inversa.Il-GSP jista 'jkun l-istess sekwenza bħall-primer ta' amplifikazzjoni li jannea sat-tarf 3'-aktar ta 'l-mRNA, jew il-GSP jista' jkun iddisinjat biex jannea 'l isfel mill-primer ta' amplifikazzjoni inversa.Għal xi suġġetti amplifikati, aktar minn primer antisens wieħed jeħtieġ li jiġi ddisinjat għal RT-PCR ta 'suċċess minħabba li l-istruttura sekondarja tal-RNA fil-mira tista' tipprevjeni l-irbit tal-primer.Huwa rakkomandat li tuża 1 pmol GSP antisens f'reazzjoni ta 'sinteżi ta' l-ewwel linja ta '20 μl.

2. Għolli t-temperatura ta 'inkubazzjoni għal traskrizzjoni inversa:

Sabiex jittieħed vantaġġ sħiħ mill-vantaġġ sħiħ tal-ispeċifiċità tal-GSP, għandha tintuża reverse transcriptase b'termostabbiltà ogħla.Reverse transcriptases termostabbli jistgħu jiġu inkubati f'temperaturi ogħla biex tiżdied l-istrettezza tar-reazzjoni.Pereżempju, jekk GSP tittempra f'55°C, l-ispeċifiċità tal-GSP ma tkunx utilizzata bis-sħiħ jekk AMV jew M-MLV jintużaw għal traskrizzjoni inversa fi strettezza baxxa ta' 37°C.Madankollu, SuperScript II u ThermoScript jistgħu jirreaġixxu f'50°C jew ogħla, li jeliminaw prodotti mhux speċifiċi ġġenerati f'temperaturi aktar baxxi.Għall-ispeċifiċità massima, it-taħlita ta 'RNA/primer tista' tiġi trasferita direttament mit-temperatura ta 'denaturazzjoni ta' 65 ° C għat-temperatura ta 'inkubazzjoni tat-traskrizzjoni inversa u miżjuda ma' taħlita ta 'reazzjoni 2× msaħħna minn qabel (sinteżi ta' cDNA hot start).Dan jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi intermolekulari f'temperaturi baxxi.It-tranżizzjonijiet tat-temperatura multipli meħtieġa għal RT-PCR jistgħu jiġu ssimplifikati bl-użu ta 'ċiklatur termali.

3. Tnaqqas il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika:

Diffikultà potenzjali li tiltaqa 'ma' RT-PCR hija l-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika fl-RNA.L-użu ta 'metodu tajjeb ta' iżolament tal-RNA, bħal Trizol Reagent, inaqqas l-ammont ta 'DNA ġenomika li jikkontamina l-preparazzjoni tal-RNA.Biex jiġu evitati prodotti derivati ​​minn DNA ġenomika, RNA jista 'jiġi ttrattat b'DNase I ta' grad ta 'amplifikazzjoni biex jitneħħa d-DNA li jikkontamina qabel it-traskrizzjoni inversa.Id-diġestjoni tad-DNase I ġiet mitmuma billi inkubaw il-kampjuni f'2.0 mM EDTA għal 10 minuti f'65°C.L-EDTA jista 'jikkelat il-jonji tal-manjeżju, u jipprevjeni l-idroliżi tal-RNA dipendenti fuq il-jone tal-manjeżju f'temperaturi għoljin.

Sabiex tissepara cDNA amplifikat minn prodotti ta 'amplifikazzjoni tad-DNA ġenomika li jikkontaminaw, primers jistgħu jiġu ddisinjati li kull anneaal biex jissepara l-esons.Prodotti tal-PCR derivati ​​minn cDNA se jkunu iqsar minn dawk derivati ​​minn DNA ġenomika kkontaminata.Barra minn hekk, sar esperiment ta 'kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa fuq kull mudell ta' RNA biex jiġi ddeterminat jekk framment partikolari kienx derivat minn DNA ġenomika jew cDNA.Il-prodott PCR miksub mingħajr traskrizzjoni inversa huwa derivat mill-ġenoma.