PCR (reazzjoni tal-katina tal-polimerażi) hija waħda mit-teknoloġiji ta 'amplifikazzjoni tad-DNA in-vitro, bi storja ta' aktar minn 30 sena.

It-teknoloġija tal-PCR kienet pijuniera minn Kary Mullis ta' Cetus, l-Istati Uniti fl-1983. Mullis applika għal privattiva tal-PCR fl-1985 u ppubblika l-ewwel karta akkademika tal-PCR dwar ix-Xjenza fl-istess sena.Mullis ingħata l-Premju Nobel fil-kimika fl-1993 għax-xogħol tiegħu.

Prinċipji Bażiċi tal-PCR

Il-PCR jista' jamplifika l-frammenti tad-DNA fil-mira b'aktar minn miljun darba.Il-prinċipju huwa taħt il-katalisi tad-DNA polymerase, bl-użu tad-DNA tal-linja ġenitur bħala mudell u primer speċifiku bħala l-punt tat-tluq għall-estensjoni.Huwa replikat in vitro permezz ta 'passi bħal denaturazzjoni, ittemprar, u estensjoni.Il-proċess tad-DNA tal-linja bint kumplimentari għad-DNA tal-mudell tal-linja ġenitur.

Il-proċess standard tal-PCR huwa maqsum fi tliet passi:

1.Denaturazzjoni: Uża temperatura għolja biex tissepara linji doppji tad-DNA.Ir-rabta tal-idroġenu bejn il-linji doppji tad-DNA tinkiser f'temperatura għolja (93-98 ℃).

2.Annealing: Wara li d-DNA ta 'stranded doppju jiġi separat, baxxi t-temperatura sabiex il-primer ikun jista' jorbot mad-DNA single-stranded.

3.Esttensjoni: Il-polimerażi tad-DNA tibda tisintetizza linji komplementari tul il-fergħat tad-DNA mill-primers marbuta meta t-temperatura titbaxxa.Meta titlesta l-estensjoni, jitlesta ċiklu, u n-numru ta 'frammenti tad-DNA jirdoppja

B'reċiproka ta 'dawn it-tliet passi 25-35 darba, in-numru ta' frammenti tad-DNA se jiżdied b'mod esponenzjali.

L-għerf tal-PCR huwa li primers differenti jistgħu jiġu ddisinjati għal ġeni fil-mira differenti, sabiex il-frammenti tal-ġeni fil-mira jkunu jistgħu jiġu amplifikati f'perjodu qasir ta 'żmien.

S'issa, il-PCR jista 'jinqasam fi tliet kategoriji, jiġifieri PCR ordinarju, PCR kwantitattiv fluworexxenti u PCR diġitali.

L-ewwel ġenerazzjoni ta 'PCR ordinarju

Uża strument ordinarju ta 'amplifikazzjoni tal-PCR biex tkabbar il-ġene fil-mira, u mbagħad uża elettroforesi tal-ġel tal-agarose biex tiskopri l-prodott, tista' ssir biss analiżi kwalitattiva.

L-iżvantaġġi ewlenin tal-PCR tal-ewwel ġenerazzjoni:

1.Suxxettibbli għal amplifikazzjoni mhux speċifika u riżultati pożittivi foloz.

2.L-iskoperta tieħu żmien twil u l-operazzjoni hija ingombranti.

3.Jista 'jsir biss test kwalitattiv

PCR Real-Time tat-tieni ġenerazzjoni

Real-Time PCR, magħruf ukoll bħala qPCR, juża sondi fluworexxenti li jistgħu jindikaw il-progress tas-sistema ta 'reazzjoni, u jimmonitorja l-akkumulazzjoni ta' prodotti amplifikati permezz tal-akkumulazzjoni ta 'sinjali fluworexxenti, u jiġġudika r-riżultati permezz tal-kurva tal-fluworexxenza.Jista 'jiġi kkwantifikat bl-għajnuna ta' valur Cq u kurva standard.

Minħabba li t-teknoloġija qPCR titwettaq f'sistema magħluqa, il-probabbiltà ta 'kontaminazzjoni titnaqqas, u s-sinjal tal-fluworexxenza jista' jiġi mmonitorjat għal skoperta kwantitattiva, għalhekk hija l-aktar użata fil-prattika klinika u saret it-teknoloġija dominanti fil-PCR.

Is-sustanzi fluworexxenti użati fil-PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali jistgħu jinqasmu: sonda fluworexxenti TaqMan, beacons molekulari u żebgħa fluworexxenti.

1)Sonda fluworexxenti TaqMan:

Waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR, tiżdied sonda fluworexxenti speċifika filwaqt li żżid par primer.Is-sonda hija oligonukleotide, u ż-żewġt itruf huma ttikkettjati bi grupp fluworexxenti reporter u grupp fluworexxenti quencher.

Meta s-sonda tkun intatta, is-sinjal fluworexxenti emess mill-grupp reporter jiġi assorbit mill-grupp tat-tifi;waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR, l-attività tal-exonuclease 5′-3′ tal-enzima Taq tinqasam u tiddegrada s-sonda, u tagħmel il-grupp fluworexxenti reporter u quencher Il-grupp fluworexxenti huwa separat, sabiex is-sistema ta 'monitoraġġ tal-fluworexxenza tkun tista' tirċievi s-sinjal tal-fluworexxenza, jiġifieri kull darba li linja tad-DNA tiġi amplifikata, sinjal fluworexxenti ta 'formazzjoni fluworexxenti u sinkronizzata hija kompletament. il-prodott PCR.

2) Żebgħa fluworexxenti SYBR:

Fis-sistema tar-reazzjoni tal-PCR, jiġi miżjud eċċess ta 'żebgħa fluworexxenti SYBR.Wara li ż-żebgħa fluworexxenti SYBR tkun inkorporata b'mod mhux speċifiku fil-linja doppja tad-DNA, temetti sinjal fluworexxenti.Il-molekula taż-żebgħa SYBR li mhix inkorporata fil-katina ma temetti ebda sinjal fluworexxenti, u b'hekk tiżgura s-sinjal fluworexxenti Iż-żieda fil-prodotti tal-PCR hija kompletament sinkronizzata maż-żieda fil-prodotti tal-PCR.SYBR jorbot biss ma 'DNA bi strand doppju, għalhekk il-kurva tat-tidwib tista' tintuża biex tiddetermina jekk ir-reazzjoni tal-PCR hijiex speċifika.

3) Xempju molekulari:

Hija sonda oligonukleotide b'tikketti doppji b'linja ta 'staminali li tifforma struttura ta' hairpin ta 'madwar 8 bażijiet fil-5 u t-3 truf.Is-sekwenzi ta 'l-aċidu nuklejku fiż-żewġt itruf huma kkomplementariment paired, li jikkawża li l-grupp fluworexxenti u l-grupp ta' tkessiħ ikunu stretti.Agħlaq, mhux se tiġi prodotta fluworexxenza.

Wara li jiġi ġġenerat il-prodott tal-PCR, matul il-proċess tal-ittemprar, il-parti tan-nofs tal-beacon molekulari hija mqabbda ma 'sekwenza speċifika tad-DNA, u l-ġene fluworexxenti huwa separat mill-ġene quencher biex jipproduċi fluworexxenza.

L-iżvantaġġi ewlenin tal-PCR tat-tieni ġenerazzjoni:

Is-sensittività għadha nieqsa, u l-iskoperta ta 'kampjuni ta' kopji baxxi mhix preċiża.

Hemm l-influwenza tal-valur tal-isfond, u r-riżultat huwa suxxettibbli għall-interferenza.

Meta jkun hemm inibituri tal-PCR fis-sistema ta 'reazzjoni, ir-riżultati ta' skoperta huma suxxettibbli għal interferenza.

PCR diġitali tat-tielet ġenerazzjoni

PCR diġitali (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) tikkalkula n-numru tal-kopja tas-sekwenza fil-mira permezz ta 'skoperta tal-punt aħħari, u tista' twettaq skoperta kwantitattiva assoluta preċiża mingħajr ma tuża kontrolli interni u kurvi standard.

Il-PCR diġitali juża skoperta tal-punt aħħari u ma jiddependix fuq il-valur Ct (limitu taċ-ċiklu), għalhekk ir-reazzjoni tal-PCR diġitali hija inqas affettwata mill-effiċjenza tal-amplifikazzjoni, u t-tolleranza għall-inibituri tar-reazzjoni tal-PCR titjieb, bi preċiżjoni għolja u riproduċibbiltà.

Minħabba l-karatteristiċi ta 'sensittività għolja u preċiżjoni għolja, mhuwiex faċilment interferit minn inibituri tar-reazzjoni tal-PCR, u jista' jikseb kwantifikazzjoni assoluta vera mingħajr prodotti standard, li sar hotspot ta 'riċerka u applikazzjoni.

Skont il-forom differenti tal-unità ta 'reazzjoni, tista' tinqasam fi tliet tipi ewlenin: sistemi mikrofluwidi, ċippa u qtar.

1) PCR diġitali mikrofluwidiku, mdPCR:

Ibbażat fuq it-teknoloġija mikrofluwidika, il-mudell tad-DNA huwa separat.It-teknoloġija mikrofluwidika tista 'tirrealizza n-nano-aġġornament tal-kampjun jew il-ġenerazzjoni ta' qtar iżgħar, iżda l-qtar jeħtieġu metodu ta 'assorbiment speċjali u mbagħad magħquda mas-sistema ta' reazzjoni PCR.mdPCR ġie adottat gradwalment b'metodi oħra jissostitwixxu.

2) PCR diġitali bbażata fuq qtar, ddPCR:

Uża teknoloġija ta 'ġenerazzjoni ta' qtar ta 'l-ilma fiż-żejt biex tipproċessa l-kampjun fi qtar, u jaqsam is-sistema ta' reazzjoni li fiha molekuli ta 'aċidu nuklejku f'eluf ta' qtar nanoskala, li kull wieħed minnhom ma fihx il-molekula fil-mira ta 'aċidu nuklejku li għandha tiġi skoperta, jew Fiha waħda sa diversi molekuli ta' mira ta 'aċidu nuklejku li għandhom jiġu ttestjati.

3) PCR diġitali bbażata fuq iċ-ċippa, cdPCR:

Uża t-teknoloġija tal-mogħdija tal-fluwidu integrata biex inċiż ħafna mikrotubi u mikrokavitajiet fuq wejfers tas-silikon jew ħġieġ tal-kwarz, u tikkontrolla l-fluss tas-soluzzjoni permezz ta 'valvi ta' kontroll differenti, u jaqsam il-likwidu tal-kampjun f'nanometri tal-istess daqs fil-bjar ta 'reazzjoni għal Reazzjoni PCR diġitali biex tinkiseb kwantifikazzjoni assoluta.

L-iżvantaġġi ewlenin tat-tielet ġenerazzjoni PCR:

It-tagħmir u r-reaġenti huma għaljin.

Ir-rekwiżiti tal-kwalità tal-mudelli huma għoljin.Jekk il-kwantità tal-mudell taqbeż il-kwantità tal-mikrosistema, ikun impossibbli li tiġi kkwantifikata, u jekk tkun żgħira wisq, l-eżattezza tal-kwantifikazzjoni titnaqqas.

Pożittivi foloz jistgħu wkoll jiġu ġġenerati meta jkun hemm amplifikazzjoni mhux speċifika.