Stabbilixxi SOP tal-esperiment tal-PCR biex tistandardizza l-imġieba tal-persunal tal-esperiment.
L-esperimentatur josserva b'mod strett il-proċeduri operattivi, u jimminimizza t-tniġġis tal-PCR li jista 'jkun ikkawżat minn fatturi umani jew jipprevjeni l-okkorrenza ta' tniġġis.Barra minn hekk, l-esperimentatur għandu jkollu l-għarfien u l-ħiliet professjonali korrispondenti, inkluża l-profiċjenza fit-tħaddim ta 'tagħmir relatat, li jiċċara l-proċess kollu tax-xogħol, ħakma tal-metodi ta' trattament ta 'kontaminazzjoni u metodi ta' kontroll tal-kwalità tal-laboratorju, u li jkun kapaċi jinterpreta b'mod korrett ir-riżultati tat-test.
Stabbilixxi laboratorju standard tal-PCR.
Il-laboratorju tal-PCR huwa maqsum f'erba 'oqsma fil-prinċipju, jiġifieri żona ta' preparazzjoni tar-reaġenti, żona ta 'proċessar tal-kampjun, żona ta' amplifikazzjoni, u żona ta 'analiżi tal-prodott ta' amplifikazzjoni.L-ewwel żewġ żoni huma żoni ta 'pre-amplifikazzjoni, u l-aħħar żewġ żoni huma żoni ta' wara l-amplifikazzjoni.Iż-żona ta 'pre-amplifikazzjoni u ż-żona ta' wara l-amplifikazzjoni għandhom ikunu strettament separati.Materjali sperimentali, reaġenti, karta ta 'reġistrazzjoni, pinen, materjali tat-tindif, eċċ., Jistgħu biss joħorġu miż-żona ta' qabel l-amplifikazzjoni għaż-żona ta 'wara l-amplifikazzjoni, jiġifieri, miż-żona ta' preparazzjoni tar-reaġent → żona ta 'proċessar tal-kampjun → żona ta' amplifikazzjoni → żona ta 'analiżi tal-prodott ta' amplifikazzjoni, u m'għandhiex tgħaddi lura .Il-fluss ta 'l-arja fil-laboratorju għandu wkoll joħroġ miż-żona ta' qabel l-amplifikazzjoni għaż-żona ta 'wara l-amplifikazzjoni, u mhux jgħaddi lura.Id-disinn ideali tal-laboratorju tal-PCR jidher hawn taħt:
Figura A: Modalità ta 'setup tal-laboratorju tal-PCR ideali bi pressjoni negattiva fil-kamra tal-buffer
Figura B: Modalità ta' setup ideali tal-laboratorju tal-PCR bi pressjoni pożittiva fil-kamra tal-buffer
Id-dijagrammi tas-setup tal-laboratorju tal-PCR mogħtija fil-Figura A u l-Figura B għandhom ikunu mod ta 'setup aktar ideali, u l-laboratorju b'kundizzjonijiet jista' jirreferi għal dan il-mod għad-disinn.Għal-laboratorji ordinarji, huwa rakkomandat li ż-żona ta 'amplifikazzjoni tal-PCR u ż-żona tal-analiżi tal-prodott jistgħu jiġu sseparati, u l-ftuħ tal-għata għandu jitnaqqas kemm jista' jkun fiż-żona tal-preparazzjoni tal-kampjun u fiż-żona tal-amplifikazzjoni tal-PCR.Ftakar: Prodotti u provvisti sperimentali fiż-żona tal-analiżi tal-prodott huma strettament ipprojbiti milli jittieħdu fiż-żona tal-preparazzjoni tal-kampjun u fiż-żona tal-amplifikazzjoni tal-PCR.
Jekk il-laboratorju jwettaq biss skoperta u identifikazzjoni tal-PCR, huwa rakkomandat li tuża PCR kwantitattiv fluworexxenti minflok PCR konvenzjonali.
Ir-riżultati ta 'skoperta ta' PCR kwantitattivi ta 'fluworexxenza jistgħu jinġabru u jiġu analizzati b'sinjali ta' fluworexxenza, għalhekk m'hemmx bżonn li tiftaħ l-għatu għall-elettroforeżi wara r-reazzjoni, li tevita l-kontaminazzjoni tal-prodott PCR ikkawżata mit-tnixxija ta 'prodotti ta' reazzjoni biex jiffurmaw aerosols.Jekk iżżid in-numru ta 'fetħiet ta' għatu matul il-pass tat-tagħbija tal-elettroforeżi tal-ġel, x'aktarx li sseħħ kontaminazzjoni tal-ajrusol.Huwa rakkomandat li tiġi promossa l-applikazzjoni ta 'PCR kwantitattiv u gradwalment tissostitwixxi PCR kwalitattiva.
Is-sistema ta 'kontaminazzjoni tal-prodott UNG anti-PCR tintuża għar-reazzjoni tal-PCR.
Is-sistema tuża dUTP minflok dTTP.Wara r-reazzjoni tal-PCR, il-prodotti kollha tal-PCR (frammenti tad-DNA) huma inkorporati mad-dUTP;fir-rawnd li jmiss ta 'reazzjoni PCR, l-enzima UNG miżjuda mas-sistema hija inkubata f'37 ° C għal 5 minuti qabel PCR, li tista' speċifikament tiddegrada l-frammenti tad-DNA kollha li fihom dUTP, u mbagħad twettaq reazzjoni PCR.Dan jista 'jneħħi kompletament il-kontaminazzjoni tal-ajrusol ikkawżata mill-prodotti tal-PCR.L-effett jidher fil-figura hawn taħt:
Nota: Għas-serje PCR diretta, tista 'tagħżel il-prodotti tas-serje tas-sistema ta' kontaminazzjoni tal-prodott anti-PCR ta 'ForegeneIssuġġerixxi
Għal-laboratorji li jwettqu ttestjar ta 'ġenotipi fuq skala kbira, huwa rakkomandat ħafna li tintuża s-sistema ta' kontaminazzjoni tal-prodott UNG anti-PCR għall-ittestjar tar-reaġenti minbarra l-kostruzzjoni ta 'laboratorji raġonevoli.
Tfakkira: L-użu ta 'din is-sistema ma jistax ineħħi l-kontaminazzjoni tal-prodott PCR li diġà ġiet ikkawżata.Għalhekk, is-sistema UNG għandha tintuża fil-bidu tat-test rilevanti, u s-sistema UNG għandha tintuża għall-amplifikazzjoni tal-PCR, sabiex tevita l-kontaminazzjoni tal-prodotti tal-PCR Pożittiv falz.
Huwa rakkomandat li tuża s-sistema Direct PCR-UNG ta 'Foregene meta twettaq testijiet fuq skala kbira, bħal:
Plant Leaf Direct PCR Kit-UNG;
Żerriegħa tal-Pjanti Direct PCR Kit-UNG;
Kit PCR Dirett tat-Tessut tal-Annimali-UNG;
Mouse Tail Direct PCR Kit-UNG;
Zebra Fish Direct PCR Kit-UNG.
Din is-serje ta 'kits minn Foregenejista 'mhux biss iwettaq sejbien tal-PCR malajr u fuq skala kbira, iżda wkoll jipprevjeni u jikkontrolla b'mod effettiv il-kontaminazzjoni tal-prodott tal-PCR.
Ħin tal-post: Mar-19-2021
