• Il-PCR huwa metodu użat biex jamplifika d-DNA minn ammont żgħir ta' mudell tad-DNA.RT-PCR juża traskrizzjoni inversa biex jipproduċi mudell tad-DNA minn sors ta 'RNA li mbagħad jista' jiġi amplifikat.
• Il-PCR u l-RT-PCR huma tipikament reazzjonijiet tal-endpoint, filwaqt li qPCR u RT-qPCR jużaw il-kinetika tar-rata tas-sintesi tal-prodott matul ir-reazzjoni tal-PCR biex jikkwantifikaw l-ammont ta 'mudell preżenti.
• Metodi aktar ġodda, bħal PCR diġitali, jipprovdu kwantifikazzjoni assoluta tal-mudell tad-DNA inizjali, filwaqt li metodi bħal PCR iżotermali jnaqqsu l-ħtieġa għal tagħmir għali biex jipprovdi riżultati affidabbli.

Reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) hija teknika ta 'bijoloġija molekulari relattivament sempliċi u użata ħafna biex tkabbar u tiskopri sekwenzi ta' DNA u RNA.Meta mqabbel ma 'metodi tradizzjonali ta' klonazzjoni u amplifikazzjoni tad-DNA, li ħafna drabi jistgħu jieħdu jiem, il-PCR teħtieġ biss ftit sigħat.Il-PCR huwa sensittiv ħafna u jeħtieġ mudell minimu għall-iskoperta u l-amplifikazzjoni ta 'sekwenzi speċifiċi.Il-metodi bażiċi tal-PCR komplew avvanzati minn sejbien sempliċi tad-DNA u tal-RNA.Hawn taħt, ipprovdejna ħarsa ġenerali lejn il-metodi differenti tal-PCR u r-reaġenti li nipprovdu f'Enzo Life Sciences għall-bżonnijiet tar-riċerka tiegħek.Aħna nimmiraw li ngħinu lix-xjenzati jaċċessaw malajr ir-reaġenti tal-PCR biex jużawhom fil-proġett ta' riċerka li jmiss tagħhom!

PCR

Għall-PCR standard, kull ma għandek bżonn huwa polimerażi tad-DNA, manjesju, nukleotidi, primers, il-mudell tad-DNA li jrid jiġi amplifikat, u thermocycler.Il-mekkaniżmu tal-PCR huwa sempliċi daqs l-iskop tiegħu: 1) DNA bi stranded doppju (dsDNA) huwa denaturat bis-sħana, 2) primers jallinjaw mal-linji tad-DNA singolu, u 3) il-primers huma estiżi permezz ta 'DNA polymerase, li jirriżultaw f'żewġ kopji tal- linja tad-DNA oriġinali.Il-proċess ta 'denaturazzjoni, ittemprar u elongazzjoni fuq serje ta' temperaturi u ħinijiet huwa magħruf bħala ċiklu wieħed ta 'amplifikazzjoni (Fig. 1).

Kull pass taċ-ċiklu għandu jiġi ottimizzat għall-mudell u s-sett tal-primer użati.Dan iċ-ċiklu huwa ripetut bejn wieħed u ieħor 20-40 darba, u l-prodott amplifikat jista 'mbagħad jiġi analizzat, tipikament permezz ta' ġel agarose (Fig. 2).

Billi l-PCR huwa metodu sensittiv ħafna u volumi żgħar ħafna huma meħtieġa għal reazzjonijiet singoli, il-preparazzjoni ta 'taħlita prinċipali għal diversi reazzjonijiet hija rakkomandata.It-taħlita prinċipali għandha titħallat sew u mbagħad tinqasam bin-numru ta 'reazzjonijiet, u tiżgura li kull reazzjoni jkun fiha l-istess ammont ta' enzima, dNTPs, u primers.Ħafna fornituri, bħal Enzo Life Sciences, joffru wkoll taħlitiet tal-PCR li diġà fihom kollox ħlief primers u l-mudell tad-DNA.

Ir-reġjuni b'ħafna guanine/ċitosina (sinjuri b'GC) jirrappreżentaw sfida fit-tekniki standard tal-PCR.Is-sekwenzi b'ħafna GC huma aktar stabbli minn sekwenzi b'kontenut GC aktar baxx.Barra minn hekk, is-sekwenzi b'ħafna GC għandhom it-tendenza li jiffurmaw strutturi sekondarji, bħal ħoloq tal-hairpin.Bħala riżultat, linji doppji b'ħafna GC huma diffiċli biex jiġu separati kompletament matul il-fażi ta 'denaturazzjoni.Konsegwentement, DNA polymerase ma tistax tisintetizza l-linja l-ġdida mingħajr xkiel.Temperatura ogħla ta 'denaturazzjoni tista' ttejjeb dan, u aġġustamenti lejn temperatura ogħla ta 'ttemprar u ħin ta' ttemprar iqsar jistgħu jipprevjenu t-twaħħil mhux speċifiku ta 'primers b'ħafna GC.Reaġenti addizzjonali jistgħu jtejbu l-amplifikazzjoni ta 'sekwenzi b'ħafna GC.DMSO, glycerol, u betaine jgħinu biex ifixklu l-istrutturi sekondarji li huma kkawżati minn interazzjonijiet GC u b'hekk jiffaċilitaw is-separazzjoni tal-fergħat doppji.

Hot Start PCR

L-amplifikazzjoni mhux speċifika hija problema li tista' sseħħ waqt il-PCR.Il-biċċa l-kbira tad-DNA polymerases li jintużaw għall-PCR jaħdmu l-aħjar f'temperaturi ta' madwar 68°C sa 72°C.L-enzima tista', madankollu, tkun attiva wkoll f'temperaturi aktar baxxi, għalkemm fi grad aktar baxx.F'temperaturi ferm taħt it-temperatura ta 'l-ittemprar, il-primers jistgħu jorbtu b'mod mhux speċifiku u jwasslu għal amplifikazzjoni mhux speċifika, anke jekk ir-reazzjoni tkun stabbilita fuq is-silġ.Dan jista 'jiġi evitat bl-użu ta' inibituri tal-polimerażi li jiddissoċjaw mid-DNA polimerażi biss ladarba tintlaħaq ċerta temperatura, għalhekk it-terminu hot start PCR.L-inibitur jista 'jkun antikorp li jorbot il-polimerażi u jiddenatura fit-temperatura ta' denaturazzjoni inizjali (95 ° C tipikament).

Polymerase ta 'Fedeltà Għolja

Filwaqt li l-polimerażi tad-DNA jamplifikaw b'mod pjuttost preċiż għas-sekwenza tal-mudell oriġinali, jistgħu jseħħu żbalji fit-tqabbil tan-nukleotidi.Nuqqas ta' qbil fl-applikazzjonijiet bħall-klonazzjoni jistgħu jirriżultaw fi traskrizzjonijiet maqtugħin, u proteini tradotti ħażin jew inattivi downstream.Biex jiġu evitati dawn it-tlaqqigħ, polimerasi b'attività ta '"qari tal-provi" ġew identifikati u inkorporati fil-fluss tax-xogħol.L-ewwel proofreading polymerase, Pfu, ġiet identifikata fl-1991 f'Pyrococcus furiosus.Din l-enzima Pfu għandha attività ta' exonuclease ta' 3' sa 5'.Hekk kif id-DNA jiġi amplifikat, l-exonuclease tneħħi nukleotidi li ma jaqblux sew fit-tarf 3' tal-linja.In-nukleotide korrett imbagħad jiġi sostitwit, u s-sintesi tad-DNA tkompli.L-identifikazzjoni ta 'sekwenzi tan-nukleotidi mhux korretti hija bbażata fuq l-affinità ta' rbit għan-nukleoside triphosphate korrett mal-enzima, fejn rbit ineffiċjenti inaqqas is-sintesi u jippermetti s-sostituzzjoni korretta.L-attività ta' qari tal-provi ta' Pfu polymerase tirriżulta f'inqas żbalji fis-sekwenza finali meta mqabbla ma' Taq DNA polymerase.F'dawn l-aħħar snin, ġew identifikati enzimi oħra tal-qari tal-provi, u saru modifiki tal-enzima Pfu oriġinali biex tkompli titnaqqas ir-rata ta 'żball waqt l-amplifikazzjoni tad-DNA.

RT-PCR

Traskrizzjoni inversa PCR, jew RT-PCR, tippermetti l-użu ta 'RNA bħala mudell.Pass addizzjonali jippermetti l-iskoperta u l-amplifikazzjoni tal-RNA.L-RNA huwa traskritt b'lura f'DNA komplementari (cDNA), bl-użu ta' reverse transcriptase.Il-kwalità u l-purità tal-mudell tal-RNA huma essenzjali għas-suċċess tal-RT-PCR.L-ewwel pass ta 'RT-PCR huwa s-sinteżi ta' ibridu DNA/RNA.Reverse transcriptase għandha wkoll funzjoni RNase H, li tiddegrada l-porzjon RNA tal-ibridu.Il-molekula tad-DNA single-stranded imbagħad titlesta bl-attività DNA polymerase dipendenti mid-DNA tar-reverse transcriptase fis-cDNA.L-effiċjenza tar-reazzjoni ta 'l-ewwel fergħa tista' taffettwa l-proċess ta 'amplifikazzjoni.Minn hawn 'il quddiem, il-proċedura standard tal-PCR tintuża biex tkabbar is-cDNA.Il-possibbiltà li l-RNA terġa 'lura fis-cDNA permezz ta' RT-PCR għandha ħafna vantaġġi, u tintuża primarjament għall-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni.L-RNA huwa single-stranded u instabbli ħafna, li jagħmilha ta 'sfida biex taħdem miegħu.Komunement iservi bħala l-ewwel pass fil-qPCR, li jikkwantifika t-traskrizzjonijiet tal-RNA f'kampjun bijoloġiku.

qPCR u RT-qPCR

Il-PCR kwantitattiv (qPCR) jintuża biex jiskopri, jikkaratterizza u jikkwantifika l-aċidi nuklejċi għal bosta applikazzjonijiet.Fl-RT-qPCR, it-traskrizzjonijiet tal-RNA spiss jiġu kkwantifikati billi jiġu traskritti b'lura f'cDNA l-ewwel, kif deskritt hawn fuq, u mbagħad qPCR titwettaq sussegwentement.Bħal fil-PCR standard, id-DNA huwa amplifikat bi tliet passi ripetuti: denaturazzjoni, ittemprar u elongazzjoni.Madankollu, fil-qPCR, it-tikkettjar fluworexxenti jippermetti l-ġbir tad-dejta hekk kif il-PCR jimxi 'l quddiem.Din it-teknika għandha ħafna benefiċċji minħabba l-firxa ta 'metodi u kimiċi disponibbli.

Fil-qPCR ibbażat fuq iż-żebgħa (tipikament aħdar), it-tikkettjar fluworexxenti jippermetti l-kwantifikazzjoni tal-molekuli tad-DNA amplifikati billi juża l-użu ta 'żebgħa li torbot dsDNA.Matul kull ċiklu, titkejjel il-fluworexxenza.Is-sinjal tal-fluworexxenza jiżdied proporzjonalment mal-ammont ta 'DNA replikat.Għalhekk, id-DNA huwa kkwantifikat f'"ħin reali" (Fig. 3).L-iżvantaġġi għall-qPCR ibbażat fuq iż-żebgħa huma li mira waħda biss tista 'tiġi eżaminata kull darba u li ż-żebgħa se torbot ma' kwalunkwe ds-DNA preżenti fil-kampjun.

Fil-qPCR ibbażat fuq is-sonda, ħafna miri jistgħu jiġu skoperti simultanjament f'kull kampjun, iżda dan jeħtieġ ottimizzazzjoni u disinn ta 'sonda(i) speċifika għall-mira użata flimkien ma' primers.Diversi tipi ta 'disinji ta' sondi huma disponibbli, iżda l-aktar tip komuni huwa sonda ta 'idroliżi, li tinkorpora fluorophore u quencher.It-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza (FRET) jipprevjeni l-emissjoni tal-fluworofor permezz tal-quencher waqt li s-sonda tkun intatta.Madankollu, matul ir-reazzjoni tal-PCR, is-sonda hija idrolizzata waqt l-estensjoni tal-primer u l-amplifikazzjoni tas-sekwenza speċifika li hija marbuta magħha.Il-qsim tas-sonda jifred il-fluworophore mill-quencher u jirriżulta f'żieda fil-fluworexxenza dipendenti mill-amplifikazzjoni (Fig. 4).Għalhekk, is-sinjal tal-fluworexxenza minn reazzjoni qPCR ibbażata fuq sonda huwa proporzjonali għall-ammont tas-sekwenza fil-mira tas-sonda preżenti fil-kampjun.Minħabba li qPCR ibbażat fuq is-sonda huwa aktar speċifiku minn qPCR ibbażat fuq iż-żebgħa, ħafna drabi hija t-teknoloġija użata f'assaġġi dijanjostiċi bbażati fuq qPCR.

Amplifikazzjoni iżotermika

It-tekniki tal-PCR imsemmija hawn fuq jirrikjedu tagħmir għali ta 'termoċiklir biex jiżdied b'mod preċiż it-temperaturi tal-kamra għall-passi ta' denaturazzjoni, ittemprar u estensjoni.Ġew żviluppati għadd ta 'tekniki li m'għandhomx bżonn apparati preċiżi bħal dawn u jistgħu jsiru f'banju ta' l-ilma sempliċi jew saħansitra fiċ-ċelloli ta 'interess.Dawn it-tekniki jissejħu kollettivament amplifikazzjoni iżotermika u xogħol ibbażat fuq amplifikazzjoni esponenzjali, lineari jew kaskata.

L-iktar tip magħruf ta 'amplifikazzjoni iżotermali hija amplifikazzjoni iżotermika medjata minn loop, jew LAMP.LAMP tuża amplifikazzjoni esponenzjali f'65⁰C biex tkabbar id-DNA jew l-RNA tal-mudell.Meta titwettaq LAMP, erba' sa sitt primers komplementari għal reġjuni tad-DNA fil-mira jintużaw ma' DNA polymerase biex jissintetizzaw DNA ġdid.Tnejn minn dawn il-primers għandhom sekwenzi kumplimentari li jirrikonoxxu sekwenzi fil-primers l-oħra u jorbtuhom, li jippermettu li tifforma struttura "loop" fid-DNA li għadu kif ġie sintetizzat li mbagħad jgħin it-temprar tal-primer f'rawnds sussegwenti ta 'amplifikazzjoni.LAMP jista 'jiġi viżwalizzat b'metodi multipli, inkluż fluworexxenza, elettroforesi tal-ġel tal-agarose, jew kolorimetrija.Il-faċilità ta’ viżwalizzazzjoni u skoperta tal-preżenza jew in-nuqqas ta’ prodott bil-kolorometrija u n-nuqqas ta’ tagħmir għali meħtieġ għamlu LAMP għażla adattata għall-ittestjar tas-SARS-CoV-2 f’żoni fejn l-ittestjar fil-laboratorju kliniku ma kienx disponibbli faċilment, jew il-ħażna u t-trasport ta’ kampjuni ma kienx fattibbli, jew f'laboratorji li qabel ma kellhomx tagħmir tat-termoċikli tal-PCR.