Materjal tal-bidu: RNA
PCR ta 'traskrizzjoni inversa kwantitattiva (RT-qPCR) huwa metodu sperimentali użat f'esperimenti PCR li juża RNA bħala l-materjal tal-bidu.F'dan il-metodu, l-RNA totali jew l-RNA messaġġier (mRNA) huwa l-ewwel traskritt f'DNA komplementari (cDNA) permezz ta' reverse transcriptase.Sussegwentement, saret reazzjoni qPCR bl-użu tas-cDNA bħala mudell.RT-qPCR intuża f'varjetà ta 'applikazzjonijiet ta' bijoloġija molekulari, inkluż analiżi tal-espressjoni tal-ġeni, validazzjoni tal-interferenza tal-RNA, validazzjoni tal-mikroarray, skoperta ta 'patoġeni, ittestjar ġenetiku u riċerka tal-mard.
Metodi f'pass wieħed u f'żewġ stadji għal RT-qPCR
RT-qPCR jista 'jitwettaq b'metodu ta' pass wieħed jew żewġ stadji.RT-qPCR f'pass wieħed jgħaqqad it-traskrizzjoni inversa u l-amplifikazzjoni tal-PCR, u jippermetti li t-transkrizzjoni inversa u d-DNA polimerażi jlestu r-reazzjoni fl-istess tubu taħt l-istess kundizzjonijiet buffer.RT-qPCR f'pass wieħed jeħtieġ biss l-użu ta' primers speċifiċi għas-sekwenza.F'RT-qPCR f'żewġ stadji, it-traskrizzjoni inversa u l-amplifikazzjoni tal-PCR jitwettqu f'żewġ tubi, bl-użu ta 'buffers ottimizzati differenti, kundizzjonijiet ta' reazzjoni u strateġiji ta 'disinn tal-primer.
| Vantaġġ | Żvantaġġ | |
| Pass Wieħed | Dan il-metodu għandu inqas żball sperimentali peress li ż-żewġ reazzjonijiet isiru f'tubu wieħed
Inqas passi ta 'pipetta jnaqqsu r-riskju ta' kontaminazzjoni
Adattat għal amplifikazzjoni/screening b'rendiment għoli, veloċi u riproduċibbli | Reazzjonijiet f'żewġ stadji ma jistgħux jiġu ottimizzati separatament
Peress li l-kundizzjonijiet tar-reazzjoni huma kompromessi billi tgħaqqad ir-reazzjoni f'żewġ stadji, is-sensittività mhix tajba daqs dik tal-metodu f'żewġ stadji
In-numru ta' miri misjuba minn kampjun wieħed huwa żgħir |
| Żewġ Passi | Kapaċità li toħloq libreriji cDNA stabbli li jistgħu jinħażnu għal perjodi twal ta 'żmien u jintużaw f'reazzjonijiet multipli
Ġeni fil-mira u ġeni ta' referenza jistgħu jiġu amplifikati mill-istess librerija ta' cDNA mingħajr il-ħtieġa ta' libreriji multipli ta' cDNA
Buffers ta' reazzjoni u kundizzjonijiet ta' reazzjoni li jippermettu l-ottimizzazzjoni ta' ġirjiet ta' reazzjoni waħda
Għażla flessibbli ta 'kundizzjonijiet ta' trigger | L-użu ta 'tubi multipli, u aktar passi ta' pipetta jżid ir-riskju ta 'kontaminazzjoni tad-DNA, u jieħu ħafna ħin.
Jeħtieġ aktar ottimizzazzjoni mill-metodu ta 'pass wieħed |
Prodotti relatati:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Pass Wieħed)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Pass Wieħed)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Għall-Ewwel Strand CDNA Sintesi
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Għażla ta 'RNA totali u mRNA
Meta tfassal esperiment RT-qPCR, huwa importanti li tiddeċiedi jekk tużax RNA totali jew mRNA purifikat bħala mudell għat-traskrizzjoni inversa.Għalkemm l-mRNA jista 'jkun kapaċi jipprovdi sensittività kemmxejn ogħla, l-RNA totali għadu jintuża ta' spiss.Ir-raġuni għal dan hija li l-RNA totali għandu vantaġġ aktar importanti bħala materjal tal-bidu mill-mRNA.L-ewwel, il-proċess jeħtieġ inqas passi ta 'purifikazzjoni, li jiżgura rkupru kwantitattiv aħjar tal-mudell u normalizzazzjoni aħjar tar-riżultati għan-numri tal-bidu taċ-ċelluli.It-tieni, jevita l-pass tal-arrikkiment tal-mRNA, li jista 'jevita l-possibbiltà ta' riżultati distorti minħabba rkupri differenti ta 'mRNAs differenti.B'mod ġenerali, peress li fil-biċċa l-kbira tal-applikazzjonijiet il-kwantifikazzjoni relattiva tal-ġene fil-mira hija aktar importanti mis-sensittività assoluta tal-kxif, l-RNA totali huwa aktar adattat f'ħafna każijiet.
Primer traskrizzjoni inversa
Fil-metodu f'żewġ stadji, jistgħu jintużaw tliet metodi differenti biex ipprajb ir-reazzjoni cDNA: primers oligo(dT), primers każwali, jew primers speċifiċi għas-sekwenza.Tipikament, primers oligo(dT) u primers każwali jintużaw flimkien.Dawn il-primes jannaw mal-linja tal-mRNA tal-mudell u jipprovdu reverse transcriptase b'punt tat-tluq għas-sintesi.
| Għażla tal-primer | Struttura u funzjoni | Vantaġġ | Żvantaġġ |
| Primer oligo(dT) (jew primer oligo(dT) ankrat) | Ittemprar estiż għar-residwi tat-timina fid-denb tal-poli(A) tal-mRNA;ankra oligo(dT) primer fih G, C, jew A fit-tarf 3′ (sit tal-ankra) | Sinteżi ta 'cDNA full-length minn mRNA ta' poly(A)-tailed
Applikabbli meta jkun hemm inqas materjal tal-bidu disponibbli
Is-sit tal-ankraġġ jiżgura li l-primer oligo(dT) jeħel mad-denb 5′ poly(A) tal-mRNA | Adattat biss għall-amplifikazzjoni tal-ġeni bi dnub poly(A).
Ikseb cDNA maqtugħ mis-sit tal-priming*2 f'poly(A)
Preġudikat biex jorbot mat-tarf 3′*
*Din il-possibbiltà hija minimizzata jekk jintużaw primers oligo(dT) ankrati |
| primer każwali
| 6 sa 9 bażijiet fit-tul, li jistgħu jittempraw għal siti multipli waqt it-traskrizzjoni tal-RNA | Anneal għall-RNAs kollha (tRNA, rRNA, u mRNA)
Adattat għal traskrizzjonijiet bi struttura sekondarja sinifikanti, jew meta jkun hemm inqas materjal tal-bidu disponibbli
Rendiment Għoli ta' cDNA | cDNA huwa traskritt bil-maqlub mill-RNA kollu, li normalment ma jkunx mixtieq u jista' jnaqqas is-sinjal tal-mRNA fil-mira
tikseb cDNA maqtugħ |
| primers speċifiċi għas-sekwenza | Primers personalizzati li jimmiraw sekwenzi speċifiċi tal-mRNA | librerija speċifika cDNA
Ittejjeb is-sensittività
Bl-użu ta 'reverse qPCR primers | Limitat biss għas-sintesi ta' ġene wieħed fil-mira |
Reverse transcriptase
Reverse transcriptase hija enzima li tuża RNA biex tisintetizza d-DNA.Xi reverse transcriptases għandhom attività RNase u jistgħu jiddegradaw linji RNA fi linji ibridi RNA-DNA wara traskrizzjoni.Jekk ma jkollux attività enżimatika RNase, RNaseH jista 'jiġi miżjud għal effiċjenza ogħla ta' qPCR.L-enzimi użati b'mod komuni jinkludu reverse transcriptase tal-virus tal-lewkimja murina Moloney u reverse transcriptase tal-virus tal-majeloblastoma tat-tjur.Għal RT-qPCR, huwa ideali li tagħżel reverse transcriptase b'termostabbiltà ogħla, sabiex is-sinteżi ta 'cDNA tkun tista' titwettaq f'temperaturi ogħla, li tiżgura traskrizzjoni b'suċċess ta 'RNAs bi struttura sekondarja ogħla, filwaqt li tinżamm l-attività sħiħa tagħhom matul ir-reazzjoni, li tirriżulta f'rendiment ogħla ta' cDNA.
Prodotti relatati:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Attività RNase H ta' reverse transcriptase
RNaseH huwa kapaċi jiddegrada linji ta 'RNA minn duplexes RNA-DNA, li jippermetti sinteżi effiċjenti ta' DNA bi stranded doppju.Madankollu, meta tuża mRNA twil bħala mudell, l-RNA jista 'jiġi degradat qabel iż-żmien, li jirriżulta f'cDNA maqtugħ.Għalhekk, ħafna drabi huwa ta 'benefiċċju li tiġi minimizzata l-attività RNaseH waqt il-klonazzjoni ta' cDNA jekk tkun mixtieqa sinteżi ta 'traskrizzjonijiet twal.B'kuntrast, reverse transcriptases b'attività RNase H ħafna drabi huma ta 'benefiċċju għal applikazzjonijiet qPCR minħabba li jtejbu t-tidwib ta' duplexes RNA-DNA matul l-ewwel ċiklu ta 'PCR.
Disinn tal-primer
Primers PCR użati għall-pass qPCR fl-RT-qPCR idealment għandhom ikunu ddisinjati biex ikopru junction exon-exon, fejn primer ta 'amplifikazzjoni jista' potenzjalment jifrex limitu attwali eson-intron.Peress li s-sekwenzi tad-DNA ġenomika li fihom introni mhumiex amplifikati, dan id-disinn inaqqas ir-riskju ta 'pożittivi foloz amplifikati minn DNA ġenomika li tikkontamina.
Jekk primers ma jistgħux jiġu ddisinjati biex jisseparaw l-esoni jew il-konfini exon-exon, jista 'jkun meħtieġ li jiġu trattati kampjuni ta' RNA b'DNase I jew dsDNase ħielsa minn RNase biex titneħħa l-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika.
Kontroll RT-qPCR
Kontroll negattiv tat-traskrizzjoni inversa (kontroll -RT) għandu jiġi inkluż fl-esperimenti RT-qPCR kollha biex tiġi identifikata l-kontaminazzjoni tad-DNA (bħal DNA ġenomika jew prodotti PCR minn reazzjonijiet preċedenti).Dan il-kontroll fih il-komponenti kollha tar-reazzjoni ħlief reverse transcriptase.Peress li t-traskrizzjoni inversa ma sseħħx b'dan il-kontroll, jekk tiġi osservata l-amplifikazzjoni tal-PCR, il-kontaminazzjoni mid-DNA hija l-aktar probabbli.
Ħin tal-post: Awissu-02-2022
