Reverse transcriptases tradizzjonali ma jistgħux jittolleraw temperaturi għoljin (it-temperatura ottima għall-attività MMLV hija 37-50 ° C, u AMV hija 42-60 ° C).L-RNA virali aktar kumpless ma jistax jiġi traskritt b'mod effettiv b'lura f'cDNA f'temperaturi baxxi, li jirriżulta f'effiċjenza ta 'skoperta It-tnaqqis.RT-qPCR tradizzjonali ġeneralment teħtieġ il-parteċipazzjoni ta 'żewġ enzimi ewlenin (reverse transcriptase u DNA polymerase), li jagħmilha impossibbli li tissimplifika l-operat tas-sistema ta' reazzjoni u titnaqqas l-ispiża.Hawnhekk se nintroduċu żewġ reverse transcriptases reżistenti għal temperatura għolja, TtH u RevTaq.Dawn iż-żewġ enzimi għandhom ukoll il-funzjoni ta 'DNA polymerase, għalhekk jissejħu enzimi bifunzjonali.

TtH DNA polimerażi

Trid smajt dwar TtH, li huwa derivat mill-batterju termofiliku Thermus thermophilus HB8.Fil-preżenza ta’ katjoni divalenti bħal Mg2+, għandu attività ta’ DNA polymerase.Huwa użat ħafna f'reazzjonijiet PCR bħall-enzima Taq, iżda għandu reżistenza ogħla tas-sħana mill-enzima Taq, għalhekk għandu wkoll effett aħjar fuq PCR b'mudelli ta 'kontenut għoli ta' GC.

· Din l-enzima bażikament m'għandha l-ebda attività 3′→5′ exonuclease u 5′→3′ attività exonuclease, għalhekk tista 'tintuża wkoll għas-sekwenzjar tad-dideoxy.

· Din l-enzima għandha attività RTase.Fil-preżenza ta 'Mn2+, l-attività RTase se tissaħħaħ.Permezz ta 'din il-karatteristika, tista' tintuża biex twettaq reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa u reazzjoni PCR fl-istess tubu, jiġifieri, RT-PCR f'pass wieħed.Madankollu, fil-preżenza ta 'Mn2 +, l-eżattezza ta' RT-PCR mhix għolja.L-attività RT m'għandha x'taqsam xejn mal-attività rnaase H.

· L-attività miżjuda ta 'Tth-DNA polymerase (pH9, ottima +55℃～+70℃, massimu +95℃) tegħleb il-problemi kkawżati mill-istruttura sekondarja RNA.Is-cDNA li jirriżulta jista' jiġi amplifikat permezz ta' PCR bl-istess enzima fil-preżenza ta' joni Mg2+.

· Il-kapaċità ta 'Tth-DNA polymerase li twettaq traskrizzjoni inversa u amplifikazzjoni tad-DNA f'temperaturi għoljin tagħmel din l-enzima utli għal RT-PCR kwantitattiv, klonazzjoni, u analiżi tal-espressjoni tal-ġeni ta' RNA ċellulari u virali.
· Tth-DNA polymerase jintuża għal RT-PCR biex jamplifika l-RNA sa 1kb.

Karatteristiċi u vantaġġi

Tth DNA polimerażi:

• Tiżgura d-daqs tal-prodott ottimizzat tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR), mill-inqas 1000 bp fir-reazzjoni RT-PCR

• Aċċetta deoxyribonucleoside triphosphate modifikat bħala sottostrat

• Mhux relatat mal-attività RNase H

• Għandu stabbiltà termali għolja biex jegħleb il-problemi, ġeneralment relatati mal-istruttura sekondarja għolja preżenti fl-RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

DNA polimerażi reżistenti għas-sħana b'attività ta' reverse transcriptase

RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase hija enzima ta' inġinerija, reżistenti ħafna għas-sħana, b'funzjoni doppja b'reverse transcriptase u DNA polymerase attivitajiet miksuba permezz ta' evoluzzjoni diretta u artifiċjali.

· Il-half-life ta' RevTaq RT-PCR DNA polymerase f'95°C hija akbar minn 40 minuta.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase jippermetti traskrizzjoni inversa f'temperatura għolja direttament mill-mudell ta 'RNA, u l-pass ta' traskrizzjoni inversa jista 'jiġi ripetut diversi drabi biex jiġġenera aktar mudelli ta' cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase jippermetti RT-PCR ta '"pass żero" (l-ebda pass ta' traskrizzjoni inversa iżotermika), minħabba li fil-pass ta 'estensjoni tal-PCR ċikliku, traskrizzjoni inversa u amplifikazzjoni tad-DNA jseħħu simultanjament.Dan jippromwovi wkoll ir-reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa f'temperaturi għoljin, u b'hekk jimminimizzaw il-problemi li jiltaqgħu magħhom fit-tidwib tal-istruttura sekondarja qawwija fl-RNA f'temperaturi għoljin.

· Minħabba l-formula hot-start ibbażata fuq aptamer, RevTaq RT-PCR DNA polymerase se tipproduċi riżultati aħjar meta t-temperatura ta 'l-ittemprar u l-estensjoni tkun ogħla minn 57 °C.

· Peress li l-enzima hija reżistenti għas-sħana, huwa rakkomandat li tiddisinja primers u sondi b'punti ta 'tidwib għoljin ħafna (> 60 ° C).

· Huwa rakkomandat li tiġi ottimizzata t-temperatura tal-pass tal-ittemprar/estensjoni permezz ta 'gradjent tat-temperatura matul il-proċess ta' twaqqif tar-reazzjoni.

· Aktar ma tkun għolja t-temperatura, iktar tkun għolja l-ispeċifiċità tal-PCR.Iċ-ċiklu tat-traskrizzjoni inversa ġeneralment jitwettaq f'temperatura ogħla miċ-ċiklu tal-PCR, minħabba li l-ibridizzazzjoni tad-DNA Primer:RNA Template normalment għandha punt ta 'tidwib ogħla minn DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase huwa ġenetikament inġinerija u ottimizzat, u d-daqs tal-amplicon huwa bejn 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polymerase limitu ta’ skoperta jilħaq 4 kopji/

Is-sistema ta 'reazzjoni ottimizzata (l-istabbiliment ta' primers ta 'punt ta' tidwib għoli) hija murija fil-figura.RevTaq RT-PCR DNA polymerase-driven RT-PCR juri sensittività aħjar minn TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, u skoperta aktar baxxa Grajjent ta 'dilwizzjoni tal-kampjun.

Aktar vantaġġi:

Funzjoni ta 'bidu malajr → Il-pass inizjali tad-denaturazzjoni termali jista' jinqabeż.

Formula tal-aptamer hot-start → Ipprovdi attività tal-enzima 100% immedjatament u tevita amplifikazzjoni mhux speċifika f'temperaturi baxxi (<57°C).

Funzjoni tal-qsim → Il-pass tal-estrazzjoni tal-RNA jitħalla barra, minħabba li RevTaq RT-PCR DNA polymerase jista 'wkoll jipproċessa kampjuni ta' reazzjoni mhux raffinati.Jista 'jeqred immedjatament il-membrani taċ-ċelluli ta' ewkarjoti, batterji u viruses f'ċiklu sħun RT-PCR.

Livell tal-materja prima IVD → standards ta 'kwalità għolja u prezzijiet estremament kompetittivi