Ⅰ. Żid is-sensittività tas-sistema ta' reazzjoni:
1. Separati RNA ta 'kwalità għolja:
Sintesi ta 'cDNA b'suċċess ġejja minn RNA ta' kwalità għolja.RNA ta 'kwalità għolja għandu jiżgura mill-inqas total itwal u ma fihx inibituri li ma fihomx enzimi ta' reġistrazzjoni, bħal EDTA jew SDS.Il-kwalità tal-RNA tiddetermina l-valur massimu tal-informazzjoni tas-sekwenza li tista’ tittraskrivi għas-cDNA.Il-metodu ġenerali ta 'purifikazzjoni tal-RNA huwa metodu ta' pass ta 'użu ta' isoocyanate/acidophenol.Sabiex jiġi evitat it-tniġġis ta 'RNase, l-RNA separat minn kampjun rikk fl-RNase (bħal frixa) jeħtieġ ħażna ta' formaldehyde biex jiffranka RNA ta 'kwalità għolja, li huwa saħansitra aktar għal ħażna fit-tul.L-RNA estratt mill-fwied tal-far kien bażikament degradat wara ġimgħa ta 'ħażna fl-ilma, filwaqt li l-RNA estratt mill-milsa tal-far baqa' stabbli wara tliet snin ta 'ħażna fl-ilma.Barra minn hekk, traskrizzjonijiet akbar minn 4kb huma aktar sensittivi għad-degradazzjoni tat-traċċa RNase minn traskrizzjonijiet żgħar.Sabiex tiżdied l-istabbiltà tal-kampjun tal-RNA tal-ħażna, l-RNA jista 'jiġi maħlul f'methalmamine ta' jone, u jinħażen -70 °C.Thylide użat biex isalva l-RNA m'għandux ikun fih oġġett mixxellanju li jiddegrada l-RNA.L-RNA, li huwa derivat mill-frixa, jista 'jiġi ffrankat fil-methalmamine għal mill-inqas sena.Meta tkun lest biex tuża l-RNA, tista 'tuża l-metodi li ġejjin biex tippreċipita l-RNA: żid NaCl għal 0.2m u 4 darbiet il-volum ta' etanol, poġġi t-temperatura tal-kamra għal 3-5 minuti, u 10,000 × g ċentrifugali għal 5 minuti.
2. Uża reverse transcriptase mingħajr attività RNaseH (RNaseH-):
Inibituri ta 'RNase huma spiss miżjuda għal reazzjonijiet ta' traskrizzjoni inversa biex iżidu t-tul u r-rendiment tas-sintesi ta 'cDNA.L-inibitur ta 'RNase huwa miżjud fl-ewwel reazzjoni ta' sintesi tal-katina fil-preżenza ta 'buffers u aġenti ta' tnaqqis bħal DTT minħabba li l-proċess ta 'sintesi ta' pre-cDNA jiddenatura l-inibitur, u b'hekk jirrilaxxa RNases marbuta li jiddegradaw l-RNA.L-inibitur tal-protein RNase jipprevjeni biss id-degradazzjoni tal-RNA minn RNase A, B, C, u ma jipprevjenix RNases fuq il-ġilda, għalhekk għandha tingħata attenzjoni biex ma tintroduċix RNases mis-swaba 'minkejja l-użu ta' dawn l-inibituri.
Reverse transcriptase tikkatalizza l-konverżjoni ta 'RNA f'cDNA.Kemm M-MLV kif ukoll AMV għandhom attività RNaseH endoġena minbarra l-attività tal-polimerażi tagħhom stess.L-attività RNaseH tikkompeti ma 'attività tal-polimerażi għal linji eterozigoti ffurmati bejn mudelli ta' RNA u primers tad-DNA jew linji ta 'estensjoni ta' cDNA, u tiddegrada linji RNA: RNA f'kumplessi tad-DNA.Mudelli ta 'RNA degradati mill-attività ta' RNaseH ma jistgħux jibqgħu jintużaw bħala substrati effettivi għas-sintesi ta 'cDNA, u jnaqqsu r-rendiment u t-tul tas-sintesi ta' cDNA.Għalhekk l-eliminazzjoni jew it-tnaqqis ħafna tal-attività ta' RNaseH ta' reverse transcriptase tkun ta' benefiċċju kbir.
SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase ta 'RNaseH- u thermoScript reverse transcriptase, AMV ta' RNaseH- taw aktar cDNA full-length minn MMLV u AMV.Is-sensittività RT-PCR hija affettwata mill-ammont ta 'cDNA sintetizzat.ThermoScript huwa ħafna aktar sensittiv minn AMV.Id-daqs tal-prodotti RT-PCR huwa limitat mill-kapaċità tar-reverse transcriptase li jissintetizza cDNA, speċjalment meta tikklona Cdnas akbar.Meta mqabbel ma 'MMLV, SuperScripⅡ żied b'mod sinifikanti r-rendiment ta' prodotti RT-PCR twal.Ir-reverse transcriptase ta 'RNaseH- iżżid ukoll l-istabbiltà termali, għalhekk ir-reazzjoni tista' titwettaq f'temperaturi ogħla min-normal ta '37-42 ℃.Taħt il-kundizzjonijiet ta 'sinteżi ssuġġeriti, intużaw primers oligo(dT) u 10μCi [alpha-p]dCTP.Il-produzzjoni totali tal-ewwel katina ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu ta 'preċipitazzjoni TCA.CDNA ta 'tul sħiħ ġie analizzat bl-użu ta' tneħħija ta 'strixxi magħżula skond id-daqs u l-għadd f'ġell ta' agarose alkalin.
3. Żid it-temperatura tal-preservazzjoni tas-sħana tat-traskrizzjoni inversa:
Temperatura ta 'żamma ogħla tgħin biex tiftaħ l-istruttura sekondarja ta' l-RNA u żżid ir-rendiment tar-reazzjoni.Għall-biċċa l-kbira tal-mudelli tal-RNA, iż-żamma tal-RNA u l-primer f'65 ° C mingħajr buffer jew melħ u mbagħad tkessaħhom malajr fuq is-silġ telimina l-biċċa l-kbira tal-istrutturi sekondarji u tippermetti li l-primers jintrabtu.Madankollu, xi mudelli għad għandhom struttura sekondarja, anke wara denaturazzjoni termali.L-amplifikazzjoni ta’ dawn il-mudelli diffiċli tista’ ssir bl-użu ta’ ThermoScript reverse transcriptase u billi r-reazzjoni tar-reverse transcriptase titqiegħed f’temperaturi ogħla biex tittejjeb l-amplifikazzjoni.Temperaturi ogħla ta’ żamma jistgħu jżidu wkoll l-ispeċifiċità, speċjalment meta s-sintesi ta’ cDNA titwettaq bl-użu ta’ primers speċifiċi għall-ġeni (GSPS) (ara l-Kapitolu 3).Jekk tuża GSP, kun żgur li l-valur Tm tal-primer huwa l-istess bħat-temperatura mistennija taż-żamma.Tużax oligo(dT) u primers każwali 'l fuq minn 60 ℃.Primers każwali jeħtieġ li jinżammu f'25 ℃ għal 10 minuti qabel ma jiżdiedu għal 60 ℃.Minbarra l-użu ta 'temperaturi ta' traskrizzjoni inversa ogħla, l-ispeċifiċità tista 'tittejjeb billi tittrasferixxi direttament it-taħlita ta' RNA/primer mit-temperatura ta 'denaturazzjoni ta' 65℃ għat-temperatura taż-żamma tat-traskrizzjoni inversa u żżid taħlita ta 'reazzjoni 2× imsaħħan minn qabel (sintesi ta' bidu termali cDNA).Dan l-approċċ jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi intermolekulari li jseħħ f'temperaturi aktar baxxi.L-użu ta 'strument PCR jissimplifika l-ħafna swiċċijiet tat-temperatura meħtieġa għall-RT-PCR.
Tth polimerażi stabilizzata bis-sħana taġixxi bħala polimerażi tad-DNA fil-preżenza ta 'Mg2+ u RNA polymerase fil-preżenza ta' Mn2+.Jista 'jżomm is-sħana sa 65℃.Madankollu, il-preżenza ta 'Mn2 + waqt PCR tnaqqas il-fedeltà, li tagħmel Tth polymerase inqas adattata għal amplifikazzjoni ta' preċiżjoni għolja, bħall-klonazzjoni ta 'cDNA.Barra minn hekk, Tth huwa inqas effiċjenti fit-traskrizzjoni inversa, li tnaqqas is-sensittività, u peress li enzima waħda tista 'twettaq traskrizzjoni inversa u PCR, reazzjonijiet ta' kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa ma jistgħux jintużaw biex jiddistingwu prodotti amplifikati ta 'cDNA minn dawk ta' DNA ġenomika kkontaminata.
4. Addittiv li jippromwovi traskrizzjoni inversa:
Iż-żieda ta 'addittivi, inklużi gliċerina u DMSO, mal-ewwel reazzjoni ta' sinteżi tal-katina tista 'tnaqqas l-istabbiltà tal-linja doppja tal-aċidu nuklejku u tbattal l-istruttura sekondarja tal-RNA.Sa 20% gliċerina jew 10% DMSO jistgħu jiġu miżjuda mingħajr ma tiġi affettwata l-attività ta 'SuperScriptⅡ jew MMLV.AMV jista 'wkoll jittollera sa 20% gliċerol mingħajr ma jnaqqas l-attività.Biex timmassimizza s-sensittività ta 'RT-PCR fir-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa SuperScriptⅡ, 10% gliċerol jista 'jiġi miżjud u iżolat f'45 ℃.Jekk 1/10 tal-prodott ta 'reazzjoni retrotraskrizzjoni huwa miżjud mal-PCR, il-konċentrazzjoni tal-gliċerol fir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni hija 0.4%, li mhix biżżejjed biex tinibixxi l-PCR.
5. Ipproċessar RNaseH:
Is-sensittività tista' tittejjeb billi jiġu ttrattati reazzjonijiet ta' sintesi ta' cDNA b'RNaseH qabel PCR.Għal xi mudelli, huwa maħsub li l-RNA fir-reazzjoni ta 'sintesi ta' cDNA jipprevjeni l-irbit ta 'prodotti amplifikati, f'liema każ it-trattament RNaseH jista' jżid is-sensittività.Ġeneralment, it-trattament RNaseH huwa meħtieġ għall-amplifikazzjoni ta 'mudell ta' mira ta 'cDNA ta' tul sħiħ relattivament twil, bħal scherożi tuberużaⅡ b'kopja baxxa.Għal dan il-mudell diffiċli, RNaseH tejjeb is-sinjal iġġenerat mis-cDNA sintetizzat minn SuperScriptⅡ jew AMV.Għall-biċċa l-kbira tar-reazzjonijiet RT-PCR, it-trattament RNaseH huwa fakultattiv minħabba li l-pass ta 'denaturazzjoni tal-PCR iżolat ta' 95℃ tipikament idrolizza l-RNA mill-kumpless RNA: DNA.
6. Metodi mtejba għall-iskoperta ta 'ammonti żgħar ta' RNA:
RT-PCR huwa partikolarment ta 'sfida meta ammonti żgħar biss ta' RNA huma disponibbli.Iż-żieda ta 'glycogen bħala trasportatur matul is-separazzjoni tal-RNA tgħin biex tiżdied ir-rendiment ta' kampjuni żgħar.Glikoġenu ħieles minn RNase jista 'jiġi miżjud fl-istess ħin ma' Trizol.Il-glikoġenu jinħall fl-ilma u jista' jibqa' fil-fażi tal-ilma bl-RNA biex jgħin fil-preċipitazzjoni sussegwenti.Il-konċentrazzjoni rakkomandata ta 'glycogen ħieles minn RNase hija 250μg/ml għal kampjuni inqas minn 50mg ta' tessut jew 106 ċelluli kkultivati.
Iż-żieda ta 'BSA acetylated biex reverse reazzjonijiet ta' traskrizzjoni bl-użu ta 'SuperScriptⅡ tista' żżid is-sensittività, u għal ammonti żgħar ta 'RNA, tnaqqas l-ammont ta' SuperScriptⅡ u żżid 40 unità ta 'inibitur nuclease RnaseOut tista' ttejjeb il-livell ta 'skoperta.Jekk jintuża glycogen fis-separazzjoni ta 'RNA, iż-żieda ta' inibituri BSA jew RNase biex ireġġgħu lura reazzjonijiet ta 'traskrizzjoni bl-użu ta' SuperScriptⅡ għadha rakkomandata.
Ⅱ. Żid l-ispeċifiċità ta 'RT-PCR
1. cNDA sinteżi:
Jistgħu jintużaw tliet metodi differenti biex tinbeda sinteżi ta 'cDNA ta' l-ewwel linja, u l-ispeċifiċità relattiva ta 'kull metodu taffettwa l-ammont u t-tip ta' cDNA sintetizzat.
Il-metodu tal-primer każwali huwa l-inqas speċifiku mit-tliet metodi.Primers huma temprat f'siti multipli matul it-traskrizzjoni biex jipproduċu cDNA ta 'tul qasir u parzjali.Dan il-metodu spiss jintuża biex jinkisbu sekwenzi terminali 5′ u cDNA minn mudelli ta 'RNA b'reġjuni strutturali sekondarji jew b'siti ta' terminazzjoni li reverse transcriptase ma jistgħux jirreplikaw.Biex tikseb l-itwal cDNA, il-proporzjon ta 'primers għal RNA f'kull kampjun ta' RNA jeħtieġ li jiġi determinat empirikament.Il-konċentrazzjoni inizjali ta 'primers każwali tvarja minn 50 sa 250ng għal kull sistema ta' reazzjoni ta '20μl.Minħabba li s-cDNA sintetizzat minn RNA totali bl-użu ta 'primers każwali huwa prinċipalment RNA ribosomali, poly(A)+RNA ġeneralment jintgħażel bħala l-mudell.
Inizjazzjoni Oligo(dT) hija aktar speċifika minn primers każwali.Jibridizza mad-denb poly(A) li jinsab fit-tarf 3′ tal-mRNA fil-biċċa l-kbira taċ-ċelloli ewkarjotiċi.Minħabba li poly(A)+RNA huwa bejn wieħed u ieħor 1% sa 2% tal-RNA totali, l-ammont u l-kumplessità ta 'cDNA huma ħafna inqas milli kieku jintużaw primers każwali.Minħabba l-ispeċifiċità għolja tiegħu, oligo(dT) ġeneralment ma jeħtieġx ottimizzazzjoni għal proporzjon ta 'RNA għal primer u għażla ta' poly(A)+.Huwa rakkomandat li tuża 0.5μg oligo(dT) għal kull sistema ta 'reazzjoni ta' 20μl.oligo (dT) 12-18 huwa adattat għal ħafna RT-PCR.Is-Sistema ThermoScript RT-PCR tipprovdi oligo(dT)20 minħabba l-istabbiltà termali tajba tagħha u hija adattata għal temperaturi ogħla ta 'żamma.
Primers speċifiċi għall-ġeni (GSP) huma l-aħjar primers speċifiċi għall-pass tat-traskrizzjoni inversa.GSP huwa oligonucleoside antisens li jista' speċifikament ibridizza ma' sekwenzi ta' destinazzjoni ta' RNA, aktar milli jannea l-Rnas kollha bħal primers każwali jew oligo(dT).Ir-regoli użati għad-disinn tal-primars tal-PCR japplikaw ukoll għad-disinn tar-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa GSP.GSP jista 'jkun l-istess sekwenza bħall-primer ta' amplifikazzjoni ittemprat fit-tarf ta 'mRNA3', jew GSP jista' jkun iddisinjat biex jiġi temprat downstream bil-primer ta 'amplifikazzjoni inversa.Għal xi oġġetti amplifikati, huwa meħtieġ li jiġi ddisinjat aktar minn primer antisens wieħed għal RT-PCR ta 'suċċess minħabba li l-istruttura sekondarja tal-RNA fil-mira tista' tipprevjeni lill-primer milli jorbot.Huwa ssuġġerit li tuża 1pmol antisense GSP fl-ewwel sistema ta 'reazzjoni ta' sintesi tal-katina ta '20μl.
2. Żid it-temperatura tal-preservazzjoni tas-sħana tat-traskrizzjoni inversa:
Sabiex jittieħed vantaġġ sħiħ mill-ispeċifiċità tal-GSP, għandha tintuża reverse transcriptase bi stabbiltà termali għolja.Reverse transcriptase stabbli għas-sħana tista 'tiġi iżolata f'temperaturi ogħla biex tiżdied ir-rigorożità tar-reazzjoni.Pereżempju, jekk GSP jiġi temprat f'55 ° C, allura l-ispeċifiċità ta 'GSP ma tiġix utilizzata bis-sħiħ jekk it-traskrizzjoni inversa titwettaq f'37 ° C b'rigorożità baxxa bl-użu ta' AMV jew M-MLV.Madankollu, SuperScripⅡ u ThermoScript jistgħu jirreaġixxu f'50℃ jew ogħla, li jeliminaw prodotti mhux speċifiċi prodotti f'temperaturi aktar baxxi.Għall-ispeċifiċità massima, it-taħlita RNA/primer tista 'tiġi trasferita direttament mit-temperatura ta' denaturazzjoni ta '65℃ għat-temperatura taż-żamma tat-traskrizzjoni inversa biż-żieda ta' taħlita ta 'reazzjoni 2 x imsaħħan minn qabel (bidu termali tas-sintesi ta' cDNA).Dan jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi bejn il-molekuli f'temperaturi baxxi.L-użu ta 'strument PCR jissimplifika l-ħafna tranżizzjonijiet tat-temperatura meħtieġa għall-RT-PCR.
3. Naqqas il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika:
Diffikultà potenzjali waħda bl-RT-PCR hija li l-RNA jikkontamina d-DNA ġenomika.L-użu ta 'metodi aħjar ta' separazzjoni ta 'RNA, bħal Trizol Reagent, inaqqas il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika fi preparazzjonijiet ta' RNA.Biex jiġu evitati prodotti prodotti minn DNA ġenomika, l-RNA jista 'jiġi ttrattat b'grad ta' amplifikazzjoni DnasⅠ biex jitneħħa DNA ikkontaminat qabel it-traskrizzjoni inversa.Il-kampjuni nżammu f'65℃ f'2.0mM EDTA għal 10 min biex tintemm id-diġestjoni tad-DNaseⅠ.L-EDTA jikkela l-joni tal-manjeżju biex jipprevjeni l-idroliżi tal-RNA dipendenti tal-jone tal-manjeżju li sseħħ f'temperaturi għoljin.
Sabiex tissepara cDNA amplifikat mill-prodott ta 'amplifikazzjoni tad-DNA tal-ġenoma, jistgħu jiġu ddisinjati primers li janneal separatament mal-exon separat.Prodotti tal-PCR derivati minn cDNA se jkunu iqsar minn dawk derivati minn DNA ġenomika kkontaminata.Jitwettaq ukoll esperiment ikkontrollat mingħajr traskrizzjoni inversa fuq kull mudell RNA biex jiġi ddeterminat jekk framment partikolari huwiex minn DNA ġenomika jew cDNA.Il-prodotti tal-PCR miksuba fin-nuqqas ta' traskrizzjoni inversa huma derivati mill-ġenoma.
Prodott Relatat
-Il-kit ta 'pass wieħed jippermetti li jsiru traskrizzjoni inversa u PCR fl-istess tubu.Jeħtieġ biss li żżid template RNA, primers PCR speċifiċi u RNase-Free ddH2O.
-Analiżi kwantitattiva f'ħin reali ta 'RNA tista' titwettaq malajr u b'mod preċiż.
-Il-kit juża reaġent uniku ta 'traskrizzjoni inversa Foregene u Foregene HotStar Taq DNA Polymerase flimkien ma' sistema ta 'reazzjoni unika biex ittejjeb b'mod effettiv l-effiċjenza ta' amplifikazzjoni u l-ispeċifiċità tar-reazzjoni.
-Is-sistema ta 'reazzjoni ottimizzata tagħmel ir-reazzjoni jkollha sensittività ta' skoperta ogħla, stabbiltà termali aktar b'saħħitha, u tolleranza aħjar.
-Kapaċità effiċjenti biex tneħħi l-gDNA, li tista 'tneħħi l-gDNA fil-mudell fi żmien 2 minuti.
-Sistema effiċjenti ta 'traskrizzjoni inversa, tieħu biss 15-il minuta biex tlesti s-sintesi tal-ewwel linja cDNA.
-Mudelli kumplessi: mudelli b'kontenut għoli ta 'GC u struttura sekondarja kumplessa jistgħu wkoll jitreġġgħu lura b'effiċjenza għolja.
-Sistema ta 'traskrizzjoni inversa ta' sensittività għolja, mudelli ta 'livell pg jistgħu wkoll jiksbu cDNA ta' kwalità għolja.
-Is-sistema ta 'traskrizzjoni inversa għandha stabbiltà termali għolja, l-aħjar temperatura ta' reazzjoni hija 42 ℃, u għad għandha prestazzjoni tajba ta 'traskrizzjoni inversa f'50 ℃.
Ħin tal-post: Mar-07-2023