• facebook
  • linkedin
  • youtube

ġdid1

. Żid is-sensittività tas-sistema ta' reazzjoni:

1. Separati RNA ta 'kwalità għolja:

Sintesi ta 'cDNA b'suċċess ġejja minn RNA ta' kwalità għolja.RNA ta 'kwalità għolja għandu jiżgura mill-inqas total itwal u ma fihx inibituri li ma fihomx enzimi ta' reġistrazzjoni, bħal EDTA jew SDS.Il-kwalità tal-RNA tiddetermina l-valur massimu tal-informazzjoni tas-sekwenza li tista’ tittraskrivi għas-cDNA.Il-metodu ġenerali ta 'purifikazzjoni tal-RNA huwa metodu ta' pass ta 'użu ta' isoocyanate/acidophenol.Sabiex jiġi evitat it-tniġġis ta 'RNase, l-RNA separat minn kampjun rikk fl-RNase (bħal frixa) jeħtieġ ħażna ta' formaldehyde biex jiffranka RNA ta 'kwalità għolja, li huwa saħansitra aktar għal ħażna fit-tul.L-RNA estratt mill-fwied tal-far kien bażikament degradat wara ġimgħa ta 'ħażna fl-ilma, filwaqt li l-RNA estratt mill-milsa tal-far baqa' stabbli wara tliet snin ta 'ħażna fl-ilma.Barra minn hekk, traskrizzjonijiet akbar minn 4kb huma aktar sensittivi għad-degradazzjoni tat-traċċa RNase minn traskrizzjonijiet żgħar.Sabiex tiżdied l-istabbiltà tal-kampjun tal-RNA tal-ħażna, l-RNA jista 'jiġi maħlul f'methalmamine ta' jone, u jinħażen -70 °C.Thylide użat biex isalva l-RNA m'għandux ikun fih oġġett mixxellanju li jiddegrada l-RNA.L-RNA, li huwa derivat mill-frixa, jista 'jiġi ffrankat fil-methalmamine għal mill-inqas sena.Meta tkun lest biex tuża l-RNA, tista 'tuża l-metodi li ġejjin biex tippreċipita l-RNA: żid NaCl għal 0.2m u 4 darbiet il-volum ta' etanol, poġġi t-temperatura tal-kamra għal 3-5 minuti, u 10,000 × g ċentrifugali għal 5 minuti.

2. Uża reverse transcriptase mingħajr attività RNaseH (RNaseH-):

Inibituri ta 'RNase huma spiss miżjuda għal reazzjonijiet ta' traskrizzjoni inversa biex iżidu t-tul u r-rendiment tas-sintesi ta 'cDNA.L-inibitur ta 'RNase huwa miżjud fl-ewwel reazzjoni ta' sintesi tal-katina fil-preżenza ta 'buffers u aġenti ta' tnaqqis bħal DTT minħabba li l-proċess ta 'sintesi ta' pre-cDNA jiddenatura l-inibitur, u b'hekk jirrilaxxa RNases marbuta li jiddegradaw l-RNA.L-inibitur tal-protein RNase jipprevjeni biss id-degradazzjoni tal-RNA minn RNase A, B, C, u ma jipprevjenix RNases fuq il-ġilda, għalhekk għandha tingħata attenzjoni biex ma tintroduċix RNases mis-swaba 'minkejja l-użu ta' dawn l-inibituri.

Reverse transcriptase tikkatalizza l-konverżjoni ta 'RNA f'cDNA.Kemm M-MLV kif ukoll AMV għandhom attività RNaseH endoġena minbarra l-attività tal-polimerażi tagħhom stess.L-attività RNaseH tikkompeti ma 'attività tal-polimerażi għal linji eterozigoti ffurmati bejn mudelli ta' RNA u primers tad-DNA jew linji ta 'estensjoni ta' cDNA, u tiddegrada linji RNA: RNA f'kumplessi tad-DNA.Mudelli ta 'RNA degradati mill-attività ta' RNaseH ma jistgħux jibqgħu jintużaw bħala substrati effettivi għas-sintesi ta 'cDNA, u jnaqqsu r-rendiment u t-tul tas-sintesi ta' cDNA.Għalhekk l-eliminazzjoni jew it-tnaqqis ħafna tal-attività ta' RNaseH ta' reverse transcriptase tkun ta' benefiċċju kbir.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase ta 'RNaseH- u thermoScript reverse transcriptase, AMV ta' RNaseH- taw aktar cDNA full-length minn MMLV u AMV.Is-sensittività RT-PCR hija affettwata mill-ammont ta 'cDNA sintetizzat.ThermoScript huwa ħafna aktar sensittiv minn AMV.Id-daqs tal-prodotti RT-PCR huwa limitat mill-kapaċità tar-reverse transcriptase li jissintetizza cDNA, speċjalment meta tikklona Cdnas akbar.Meta mqabbel ma 'MMLV, SuperScripⅡ żied b'mod sinifikanti r-rendiment ta' prodotti RT-PCR twal.Ir-reverse transcriptase ta 'RNaseH- iżżid ukoll l-istabbiltà termali, għalhekk ir-reazzjoni tista' titwettaq f'temperaturi ogħla min-normal ta '37-42 ℃.Taħt il-kundizzjonijiet ta 'sinteżi ssuġġeriti, intużaw primers oligo(dT) u 10μCi [alpha-p]dCTP.Il-produzzjoni totali tal-ewwel katina ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu ta 'preċipitazzjoni TCA.CDNA ta 'tul sħiħ ġie analizzat bl-użu ta' tneħħija ta 'strixxi magħżula skond id-daqs u l-għadd f'ġell ta' agarose alkalin.

3. Żid it-temperatura tal-preservazzjoni tas-sħana tat-traskrizzjoni inversa:

Temperatura ta 'żamma ogħla tgħin biex tiftaħ l-istruttura sekondarja ta' l-RNA u żżid ir-rendiment tar-reazzjoni.Għall-biċċa l-kbira tal-mudelli tal-RNA, iż-żamma tal-RNA u l-primer f'65 ° C mingħajr buffer jew melħ u mbagħad tkessaħhom malajr fuq is-silġ telimina l-biċċa l-kbira tal-istrutturi sekondarji u tippermetti li l-primers jintrabtu.Madankollu, xi mudelli għad għandhom struttura sekondarja, anke wara denaturazzjoni termali.L-amplifikazzjoni ta’ dawn il-mudelli diffiċli tista’ ssir bl-użu ta’ ThermoScript reverse transcriptase u billi r-reazzjoni tar-reverse transcriptase titqiegħed f’temperaturi ogħla biex tittejjeb l-amplifikazzjoni.Temperaturi ogħla ta’ żamma jistgħu jżidu wkoll l-ispeċifiċità, speċjalment meta s-sintesi ta’ cDNA titwettaq bl-użu ta’ primers speċifiċi għall-ġeni (GSPS) (ara l-Kapitolu 3).Jekk tuża GSP, kun żgur li l-valur Tm tal-primer huwa l-istess bħat-temperatura mistennija taż-żamma.Tużax oligo(dT) u primers każwali 'l fuq minn 60 ℃.Primers każwali jeħtieġ li jinżammu f'25 ℃ għal 10 minuti qabel ma jiżdiedu għal 60 ℃.Minbarra l-użu ta 'temperaturi ta' traskrizzjoni inversa ogħla, l-ispeċifiċità tista 'tittejjeb billi tittrasferixxi direttament it-taħlita ta' RNA/primer mit-temperatura ta 'denaturazzjoni ta' 65℃ għat-temperatura taż-żamma tat-traskrizzjoni inversa u żżid taħlita ta 'reazzjoni 2× imsaħħan minn qabel (sintesi ta' bidu termali cDNA).Dan l-approċċ jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi intermolekulari li jseħħ f'temperaturi aktar baxxi.L-użu ta 'strument PCR jissimplifika l-ħafna swiċċijiet tat-temperatura meħtieġa għall-RT-PCR.

Tth polimerażi stabilizzata bis-sħana taġixxi bħala polimerażi tad-DNA fil-preżenza ta 'Mg2+ u RNA polymerase fil-preżenza ta' Mn2+.Jista 'jżomm is-sħana sa 65℃.Madankollu, il-preżenza ta 'Mn2 + waqt PCR tnaqqas il-fedeltà, li tagħmel Tth polymerase inqas adattata għal amplifikazzjoni ta' preċiżjoni għolja, bħall-klonazzjoni ta 'cDNA.Barra minn hekk, Tth huwa inqas effiċjenti fit-traskrizzjoni inversa, li tnaqqas is-sensittività, u peress li enzima waħda tista 'twettaq traskrizzjoni inversa u PCR, reazzjonijiet ta' kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa ma jistgħux jintużaw biex jiddistingwu prodotti amplifikati ta 'cDNA minn dawk ta' DNA ġenomika kkontaminata.

4. Addittiv li jippromwovi traskrizzjoni inversa:

Iż-żieda ta 'addittivi, inklużi gliċerina u DMSO, mal-ewwel reazzjoni ta' sinteżi tal-katina tista 'tnaqqas l-istabbiltà tal-linja doppja tal-aċidu nuklejku u tbattal l-istruttura sekondarja tal-RNA.Sa 20% gliċerina jew 10% DMSO jistgħu jiġu miżjuda mingħajr ma tiġi affettwata l-attività ta 'SuperScriptⅡ jew MMLV.AMV jista 'wkoll jittollera sa 20% gliċerol mingħajr ma jnaqqas l-attività.Biex timmassimizza s-sensittività ta 'RT-PCR fir-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa SuperScriptⅡ, 10% gliċerol jista 'jiġi miżjud u iżolat f'45 ℃.Jekk 1/10 tal-prodott ta 'reazzjoni retrotraskrizzjoni huwa miżjud mal-PCR, il-konċentrazzjoni tal-gliċerol fir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni hija 0.4%, li mhix biżżejjed biex tinibixxi l-PCR.

5. Ipproċessar RNaseH:

Is-sensittività tista' tittejjeb billi jiġu ttrattati reazzjonijiet ta' sintesi ta' cDNA b'RNaseH qabel PCR.Għal xi mudelli, huwa maħsub li l-RNA fir-reazzjoni ta 'sintesi ta' cDNA jipprevjeni l-irbit ta 'prodotti amplifikati, f'liema każ it-trattament RNaseH jista' jżid is-sensittività.Ġeneralment, it-trattament RNaseH huwa meħtieġ għall-amplifikazzjoni ta 'mudell ta' mira ta 'cDNA ta' tul sħiħ relattivament twil, bħal scherożi tuberużaⅡ b'kopja baxxa.Għal dan il-mudell diffiċli, RNaseH tejjeb is-sinjal iġġenerat mis-cDNA sintetizzat minn SuperScriptⅡ jew AMV.Għall-biċċa l-kbira tar-reazzjonijiet RT-PCR, it-trattament RNaseH huwa fakultattiv minħabba li l-pass ta 'denaturazzjoni tal-PCR iżolat ta' 95℃ tipikament idrolizza l-RNA mill-kumpless RNA: DNA.

6. Metodi mtejba għall-iskoperta ta 'ammonti żgħar ta' RNA:

RT-PCR huwa partikolarment ta 'sfida meta ammonti żgħar biss ta' RNA huma disponibbli.Iż-żieda ta 'glycogen bħala trasportatur matul is-separazzjoni tal-RNA tgħin biex tiżdied ir-rendiment ta' kampjuni żgħar.Glikoġenu ħieles minn RNase jista 'jiġi miżjud fl-istess ħin ma' Trizol.Il-glikoġenu jinħall fl-ilma u jista' jibqa' fil-fażi tal-ilma bl-RNA biex jgħin fil-preċipitazzjoni sussegwenti.Il-konċentrazzjoni rakkomandata ta 'glycogen ħieles minn RNase hija 250μg/ml għal kampjuni inqas minn 50mg ta' tessut jew 106 ċelluli kkultivati.

Iż-żieda ta 'BSA acetylated biex reverse reazzjonijiet ta' traskrizzjoni bl-użu ta 'SuperScriptⅡ tista' żżid is-sensittività, u għal ammonti żgħar ta 'RNA, tnaqqas l-ammont ta' SuperScriptⅡ u żżid 40 unità ta 'inibitur nuclease RnaseOut tista' ttejjeb il-livell ta 'skoperta.Jekk jintuża glycogen fis-separazzjoni ta 'RNA, iż-żieda ta' inibituri BSA jew RNase biex ireġġgħu lura reazzjonijiet ta 'traskrizzjoni bl-użu ta' SuperScriptⅡ għadha rakkomandata.

. Żid l-ispeċifiċità ta 'RT-PCR

1. cNDA sinteżi:

Jistgħu jintużaw tliet metodi differenti biex tinbeda sinteżi ta 'cDNA ta' l-ewwel linja, u l-ispeċifiċità relattiva ta 'kull metodu taffettwa l-ammont u t-tip ta' cDNA sintetizzat.

Il-metodu tal-primer każwali huwa l-inqas speċifiku mit-tliet metodi.Primers huma temprat f'siti multipli matul it-traskrizzjoni biex jipproduċu cDNA ta 'tul qasir u parzjali.Dan il-metodu spiss jintuża biex jinkisbu sekwenzi terminali 5′ u cDNA minn mudelli ta 'RNA b'reġjuni strutturali sekondarji jew b'siti ta' terminazzjoni li reverse transcriptase ma jistgħux jirreplikaw.Biex tikseb l-itwal cDNA, il-proporzjon ta 'primers għal RNA f'kull kampjun ta' RNA jeħtieġ li jiġi determinat empirikament.Il-konċentrazzjoni inizjali ta 'primers każwali tvarja minn 50 sa 250ng għal kull sistema ta' reazzjoni ta '20μl.Minħabba li s-cDNA sintetizzat minn RNA totali bl-użu ta 'primers każwali huwa prinċipalment RNA ribosomali, poly(A)+RNA ġeneralment jintgħażel bħala l-mudell.

Inizjazzjoni Oligo(dT) hija aktar speċifika minn primers każwali.Jibridizza mad-denb poly(A) li jinsab fit-tarf 3′ tal-mRNA fil-biċċa l-kbira taċ-ċelloli ewkarjotiċi.Minħabba li poly(A)+RNA huwa bejn wieħed u ieħor 1% sa 2% tal-RNA totali, l-ammont u l-kumplessità ta 'cDNA huma ħafna inqas milli kieku jintużaw primers każwali.Minħabba l-ispeċifiċità għolja tiegħu, oligo(dT) ġeneralment ma jeħtieġx ottimizzazzjoni għal proporzjon ta 'RNA għal primer u għażla ta' poly(A)+.Huwa rakkomandat li tuża 0.5μg oligo(dT) għal kull sistema ta 'reazzjoni ta' 20μl.oligo (dT) 12-18 huwa adattat għal ħafna RT-PCR.Is-Sistema ThermoScript RT-PCR tipprovdi oligo(dT)20 minħabba l-istabbiltà termali tajba tagħha u hija adattata għal temperaturi ogħla ta 'żamma.

Primers speċifiċi għall-ġeni (GSP) huma l-aħjar primers speċifiċi għall-pass tat-traskrizzjoni inversa.GSP huwa oligonucleoside antisens li jista' speċifikament ibridizza ma' sekwenzi ta' destinazzjoni ta' RNA, aktar milli jannea l-Rnas kollha bħal primers każwali jew oligo(dT).Ir-regoli użati għad-disinn tal-primars tal-PCR japplikaw ukoll għad-disinn tar-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa GSP.GSP jista 'jkun l-istess sekwenza bħall-primer ta' amplifikazzjoni ittemprat fit-tarf ta 'mRNA3', jew GSP jista' jkun iddisinjat biex jiġi temprat downstream bil-primer ta 'amplifikazzjoni inversa.Għal xi oġġetti amplifikati, huwa meħtieġ li jiġi ddisinjat aktar minn primer antisens wieħed għal RT-PCR ta 'suċċess minħabba li l-istruttura sekondarja tal-RNA fil-mira tista' tipprevjeni lill-primer milli jorbot.Huwa ssuġġerit li tuża 1pmol antisense GSP fl-ewwel sistema ta 'reazzjoni ta' sintesi tal-katina ta '20μl.

2. Żid it-temperatura tal-preservazzjoni tas-sħana tat-traskrizzjoni inversa:

Sabiex jittieħed vantaġġ sħiħ mill-ispeċifiċità tal-GSP, għandha tintuża reverse transcriptase bi stabbiltà termali għolja.Reverse transcriptase stabbli għas-sħana tista 'tiġi iżolata f'temperaturi ogħla biex tiżdied ir-rigorożità tar-reazzjoni.Pereżempju, jekk GSP jiġi temprat f'55 ° C, allura l-ispeċifiċità ta 'GSP ma tiġix utilizzata bis-sħiħ jekk it-traskrizzjoni inversa titwettaq f'37 ° C b'rigorożità baxxa bl-użu ta' AMV jew M-MLV.Madankollu, SuperScripⅡ u ThermoScript jistgħu jirreaġixxu f'50℃ jew ogħla, li jeliminaw prodotti mhux speċifiċi prodotti f'temperaturi aktar baxxi.Għall-ispeċifiċità massima, it-taħlita RNA/primer tista 'tiġi trasferita direttament mit-temperatura ta' denaturazzjoni ta '65℃ għat-temperatura taż-żamma tat-traskrizzjoni inversa biż-żieda ta' taħlita ta 'reazzjoni 2 x imsaħħan minn qabel (bidu termali tas-sintesi ta' cDNA).Dan jgħin biex jipprevjeni t-tqabbil tal-bażi bejn il-molekuli f'temperaturi baxxi.L-użu ta 'strument PCR jissimplifika l-ħafna tranżizzjonijiet tat-temperatura meħtieġa għall-RT-PCR.

3. Naqqas il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika:

Diffikultà potenzjali waħda bl-RT-PCR hija li l-RNA jikkontamina d-DNA ġenomika.L-użu ta 'metodi aħjar ta' separazzjoni ta 'RNA, bħal Trizol Reagent, inaqqas il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika fi preparazzjonijiet ta' RNA.Biex jiġu evitati prodotti prodotti minn DNA ġenomika, l-RNA jista 'jiġi ttrattat b'grad ta' amplifikazzjoni DnasⅠ biex jitneħħa DNA ikkontaminat qabel it-traskrizzjoni inversa.Il-kampjuni nżammu f'65℃ f'2.0mM EDTA għal 10 min biex tintemm id-diġestjoni tad-DNaseⅠ.L-EDTA jikkela l-joni tal-manjeżju biex jipprevjeni l-idroliżi tal-RNA dipendenti tal-jone tal-manjeżju li sseħħ f'temperaturi għoljin.

Sabiex tissepara cDNA amplifikat mill-prodott ta 'amplifikazzjoni tad-DNA tal-ġenoma, jistgħu jiġu ddisinjati primers li janneal separatament mal-exon separat.Prodotti tal-PCR derivati ​​minn cDNA se jkunu iqsar minn dawk derivati ​​minn DNA ġenomika kkontaminata.Jitwettaq ukoll esperiment ikkontrollat ​​mingħajr traskrizzjoni inversa fuq kull mudell RNA biex jiġi ddeterminat jekk framment partikolari huwiex minn DNA ġenomika jew cDNA.Il-prodotti tal-PCR miksuba fin-nuqqas ta' traskrizzjoni inversa huma derivati ​​mill-ġenoma.

Prodott Relatat

ġdid2

 

RT-PCR FaċliᵀᴹI (Pass Wieħed)

-Il-kit ta 'pass wieħed jippermetti li jsiru traskrizzjoni inversa u PCR fl-istess tubu.Jeħtieġ biss li żżid template RNA, primers PCR speċifiċi u RNase-Free ddH2O.

-Analiżi kwantitattiva f'ħin reali ta 'RNA tista' titwettaq malajr u b'mod preċiż.

-Il-kit juża reaġent uniku ta 'traskrizzjoni inversa Foregene u Foregene HotStar Taq DNA Polymerase flimkien ma' sistema ta 'reazzjoni unika biex ittejjeb b'mod effettiv l-effiċjenza ta' amplifikazzjoni u l-ispeċifiċità tar-reazzjoni.

-Is-sistema ta 'reazzjoni ottimizzata tagħmel ir-reazzjoni jkollha sensittività ta' skoperta ogħla, stabbiltà termali aktar b'saħħitha, u tolleranza aħjar.

ġdid3

 

RT Easy II (Bil-GDNase) Master Premix għas-Sinteżi CDNA tal-Ewwel Strand Għal PCR f'Ħin Reali B'GDNase

-Kapaċità effiċjenti biex tneħħi l-gDNA, li tista 'tneħħi l-gDNA fil-mudell fi żmien 2 minuti.

-Sistema effiċjenti ta 'traskrizzjoni inversa, tieħu biss 15-il minuta biex tlesti s-sintesi tal-ewwel linja cDNA.

-Mudelli kumplessi: mudelli b'kontenut għoli ta 'GC u struttura sekondarja kumplessa jistgħu wkoll jitreġġgħu lura b'effiċjenza għolja.

-Sistema ta 'traskrizzjoni inversa ta' sensittività għolja, mudelli ta 'livell pg jistgħu wkoll jiksbu cDNA ta' kwalità għolja.

-Is-sistema ta 'traskrizzjoni inversa għandha stabbiltà termali għolja, l-aħjar temperatura ta' reazzjoni hija 42 ℃, u għad għandha prestazzjoni tajba ta 'traskrizzjoni inversa f'50 ℃.


Ħin tal-post: Mar-07-2023