• facebook
  • linkedin
  • youtube

Bħala waħda ġdida fil-laboratorju, mhuwiex xogħol tajjeb li tgħarbel pjanti pożittivi minn mazz ta 'pjanti b'rata ta' konverżjoni baxxa.L-ewwelnett, id-DNA għandu jiġi estratt minn numru kbir ta 'kampjuni wieħed wieħed, u mbagħad il-ġeni barranin jiġu skoperti mill-PCR.Madankollu, ir-riżultati huma spiss vojt u meded bi ftit oġġetti okkażjonalment, iżda huwa impossibbli li jiġi ddeterminat jekk hemmx skoperti mitlufa jew skoperti foloz..Huwa bla sahha kbira li tiffaċċja tali proċess u riżultati sperimentali?Tinkwetax, brother jgħallem kif tgħarbel il-pjanti pożittivi transġeniċi faċilment u b'mod preċiż.

Pass 1

Disinn primers ta 'skoperta

Rapidu1

Iddetermina l-ġene endoġenu u l-ġene eżoġenu li għandhom jiġu skoperti skond il-kampjun li jrid jiġi ttestjat, u agħżel sekwenza rappreżentattiva ta '100-500bp fil-ġene għad-disinn tal-primer.Primers tajbin jistgħu jiżguraw l-eżattezza tar-riżultati ta 'skoperta u jqassru l-ħin ta' skoperta (ara l-appendiċi għal primers ta 'skoperta użati b'mod komuni).

Avviż: Il-primers iddisinjati ġodda jeħtieġ li jottimizzaw il-kundizzjonijiet tar-reazzjoni u jivverifikaw l-eżattezza, il-preċiżjoni u l-limitu ta 'skoperta ta' skoperta qabel skoperta fuq skala kbira.

Pass 2

Disinn protokoll sperimentali

Rapidu2

Kontroll pożittiv: Uża d-DNA purifikat li jkun fih il-framment fil-mira bħala mudell biex tiddetermina jekk is-sistema u l-kundizzjonijiet tar-reazzjoni tal-PCR humiex normali.

Kontroll negattiv/vojt: Uża l-mudell tad-DNA jew ddH2O li ma fihx il-framment fil-mira bħala mudell biex tiskopri jekk hemmx sors ta’ kontaminazzjoni fis-sistema PCR.

Kontroll ta' referenza intern: uża l-kombinazzjoni primer/sonda tal-ġene endoġenu tal-kampjun li jrid jiġi ttestjat biex tevalwa jekk il-mudell jistax jiġi skopert mill-PCR.

Avviż:

Għandhom jiġu stabbiliti kontrolli pożittivi, negattivi/vojta u kontrolli ta' kontroll intern għal kull test biex tiġi evalwata l-validità tar-riżultati sperimentali.

Preparazzjoni tal-esperimenti

Rapidu3

Qabel l-użu, osserva jekk is-soluzzjoni titħallatx indaqs.Jekk tinstab preċipitazzjoni, jeħtieġ li tinħall u titħallat skond l-istruzzjonijiet qabel l-użu.It-taħlita 2×PCR jeħtieġ li tiġi pipettata u mħallta ripetutament b'mikropipetta qabel l-użu biex tiġi evitata distribuzzjoni irregolari tal-joni.

Avviż:

Oħroġ il-manwal u aqrah bir-reqqa, u agħmel preparazzjonijiet qabel l-esperiment f'konformità stretta mar-rekwiżiti tal-manwal.

Pass 4

Ipprepara sistema ta 'reazzjoni PCR

Rapidu4

Skont il-protokoll sperimentali, ħallat il-primers, H2O, u 2 × PCR ħallat indaqs, ċentrifuga u qassamhom għal kull tubu ta 'reazzjoni.

Avviż:

Għal ttestjar fuq skala kbira jew fit-tul, huwa rakkomandat li tintuża sistema ta 'reazzjoni tal-PCR li jkun fiha l-enzima UNG, li tista' tevita b'mod effettiv il-kontaminazzjoni tal-ajrusol ikkawżata minn prodotti tal-PCR.

Pass 5

Żid il-mudell tar-reazzjoni

Rapidu5

Bl-użu tat-teknoloġija Direct PCR, m'hemmx bżonn ta 'proċess tedious ta' purifikazzjoni ta 'aċidu nuklejku, il-mudell tal-kampjun jista' jiġi ppreparat fi żmien 10 minuti, u s-sistema ta 'reazzjoni PCR korrispondenti tista' tiġi miżjuda.

Avviż:

Il-metodu ta 'qsim għandu effett ta' skoperta aħjar, u l-prodott miksub jista 'jintuża għal reazzjonijiet ta' skoperta multipli.

Rapidu6

5.1: Espansjoni diretta tal-weraq

Skont id-daqs tal-istampa fil-manwal, aqta 't-tessut tal-weraq b'dijametru ta' 2-3mm u poġġih fis-sistema ta 'reazzjoni PCR.

Nota: Żgura li l-frammenti tal-weraq huma mgħaddsa kompletament fis-soluzzjoni tar-reazzjoni tal-PCR, u ma żżidx tessut tal-weraq eċċessiv.

5.2: Metodu tal-qasma tal-weraq

Aqta 't-tessut tal-weraq b'dijametru ta' 5-7mm u poġġih f'tubu ċentrifugu.Jekk tagħżel weraq maturi, jekk jogħġbok evita li tuża t-tessuti tal-vina prinċipali tal-werqa.Pipetta 50ul Buffer P1 lysate f'tubu ċentrifugu biex tiżgura li l-lisat jista 'jgħaddas kompletament it-tessut tal-weraq, poġġih f'ċiklatur termali jew banju tal-metall, u lyse f'95 ° C għal 5-10 minuti.

Rapidu7

Żid 50ul Buffer P2 newtralizzazzjoni soluzzjoni u ħawwad sew.Il-lisat li jirriżulta jista 'jintuża bħala mudell u miżjud mas-sistema ta' reazzjoni tal-PCR.

Nota: L-ammont ta 'mudell huwa bejn 5-10% tas-sistema PCR, u m'għandux jaqbeż l-20% (per eżempju, f'sistema PCR ta' 20μl, żid 1-2μl ta 'soluzzjoni ta' liżi, mhux aktar minn 4μl).

Pass 6

Reazzjoni tal-PCR

Rapidu8

Wara li tiċċentrifuga t-tubu tar-reazzjoni tal-PCR, titqiegħed fi strument tal-PCR għall-amplifikazzjoni.

Avviż:

Ir-reazzjoni tuża mudell mhux purifikat għall-amplifikazzjoni, għalhekk in-numru ta 'ċikli ta' amplifikazzjoni huwa 5-10 ċikli aktar milli meta jintuża mudell tad-DNA purifikat.

Pass 7

Sejbien ta 'elettroforesi u analiżi tar-riżultati

Rapidu9

M: Sellum tad-DNA 100bp

1\4: Metodu tad-DNA purifikat

2\5: Metodu PCR dirett

3\6: Kontroll vojt

QC:

Ir-riżultati tat-test tal-kontrolli varji stabbiliti fl-esperiment għandhom jissodisfaw il-kundizzjonijiet li ġejjin.Inkella, il-kawża tal-problema għandha tiġi analizzata, u t-test għandu jerġa 'jwettaq wara li l-problema tiġi eliminata.

Tabella 1. Riżultati normali tat-test ta 'diversi gruppi ta' kontroll

*Meta l-plasmid jintuża bħala kontroll pożittiv, ir-riżultat tat-test tal-ġene endoġenu jista 'jkun negattiv

Ġudizzju tar-riżultat:

A. Ir-riżultat tat-test tal-ġene endoġenu tal-kampjun huwa negattiv, li jindika li d-DNA adattat għal skoperta ta 'PCR ordinarja ma jistax jiġi estratt mill-kampjun jew id-DNA estratt fih inibituri tar-reazzjoni tal-PCR, u d-DNA għandu jerġa' jiġi estratt.

B. Ir-riżultat tat-test tal-ġene endoġenu tal-kampjun huwa pożittiv, u r-riżultat tat-test tal-ġene eżoġenu huwa negattiv, li jindika li DNA adattat għal skoperta PCR ordinarja huwa estratt mill-kampjun, u jista 'jiġi ġġudikat li l-ġene XXX ma jinstabx fil-kampjun.

C. Ir-riżultat tat-test tal-ġene endoġenu tal-kampjun huwa pożittiv, u r-riżultat tat-test tal-ġene eżoġenu huwa pożittiv, li jindika li DNA adattat għal skoperta PCR ordinarja ġie estratt mill-kampjun, u l-kampjun tad-DNA fih il-ġene XXX.Jistgħu jsiru aktar esperimenti ta' konferma.

Pass 8

Disinn primers ta 'skoperta

Rapidu10

Wara l-esperiment, uża 2% soluzzjoni ta 'ipoklorit tas-sodju u 70% soluzzjoni ta' etanol biex timsaħ iż-żona sperimentali biex tevita t-tniġġis ambjentali.


Ħin tal-post: Settembru-08-2021