RT-qPCR huwa żviluppat minn teknoloġija PCR ordinarja.Iżid kimiċi fluworexxenti (żebgħat fluworexxenti jew sondi fluworexxenti) mas-sistema ta 'reazzjoni PCR tradizzjonali, u jiskopri l-proċess ta' ittemprar u estensjoni tal-PCR f'ħin reali skont il-mekkaniżmi luminexxenti differenti tagħhom.Bidliet tas-sinjali fluworexxenti fil-medju jintużaw biex jiġi kkalkulat l-ammont ta 'bidla tal-prodott f'kull ċiklu ta' PCR.Bħalissa, l-aktar metodi komuni huma l-metodu taż-żebgħa fluworexxenti u l-metodu tas-sonda.

Metodu taż-żebgħa fluworexxenti:
Xi żebgħa fluworexxenti, bħal SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, eċċ., Ma jarmux dawl waħedhom, iżda jarmu fluworexxenza wara li jorbtu mal-kanal minuri tad-dsDNA.Għalhekk, fil-bidu tar-reazzjoni tal-PCR, il-magna ma tistax tiskopri s-sinjal fluworexxenti.Meta r-reazzjoni tipproċedi għall-estensjoni tal-ittemprar (metodu f'żewġ stadji) jew stadju ta 'estensjoni (metodu ta' tliet stadji), il-linji doppji jinfetħu f'dan il-ħin, u d-DNA polimerażi l-ġdida Waqt is-sintesi tal-linji, molekuli fluworexxenti huma kkombinati fil-kanal minuri dsDNA u jarmu fluworexxenza.Hekk kif in-numru ta 'ċikli tal-PCR jiżdied, aktar u aktar żebgħa jikkombinaw ma' dsDNA, u s-sinjal fluworexxenti huwa wkoll imtejjeb kontinwament.Ħu SYBR Green Ⅰ bħala eżempju.
Metodu tas-sonda:
Is-sonda Taqman hija s-sonda tal-idroliżi l-aktar użata b'mod komuni.Hemm grupp fluworexxenti fit-tarf 5' tas-sonda, normalment FAM.Is-sonda nnifisha hija sekwenza kumplimentari għall-ġene fil-mira.Hemm grupp ta 'tifi fluworexxenti fit-tarf 3' tal-fluworofor.Skont il-prinċipju tat-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza (Förster resonance energy transfer, FRET), meta l-grupp fluworexxenti reporter (molekula fluworexxenti donatur) u l-grupp fluworexxenti li jkessaħ (molekula fluworexxenti aċċettatur) Meta l-ispettru tal-eċitazzjoni jikkoinċidi u d-distanza hija qrib ħafna (7-10nm), l-eċitazzjoni tad-donatur jista 'jaċċetta l-molekula fluworexxenti, filwaqt li l-molekula fluworexxenti huwa mdgħajjef.Għalhekk, fil-bidu tar-reazzjoni tal-PCR, meta s-sonda tkun ħielsa u intatta fis-sistema, il-grupp fluworexxenti reporter mhux se jarmu fluworexxenza.Meta l-ittemprar, il-primer u s-sonda jorbtu mal-mudell.Matul l-istadju ta 'estensjoni, il-polimerażi kontinwament tisintetizza ktajjen ġodda.DNA polymerase għandha attività eżonukleażi 5′-3′.Meta tilħaq is-sonda, id-DNA polymerase se idrolizza s-sonda mill-mudell, tissepara l-grupp fluworexxenti reporter mill-grupp fluworexxenti quencher, u tirrilaxxa s-sinjal fluworexxenti.Peress li hemm relazzjoni waħda għal waħda bejn is-sonda u l-mudell, il-metodu tas-sonda huwa superjuri għall-metodu taż-żebgħa f'termini ta 'eżattezza u sensittività tat-test.

Fig 1 Prinċipju ta 'qRT-PCR

Disinn tal-primer
Prinċipji:

Il-primers għandhom ikunu ddisinjati fir-reġjun konservat tas-serje tal-aċidu nuklejku u għandhom speċifiċità.

Huwa aħjar li tuża sekwenza cDNA, u sekwenza mRNA hija wkoll aċċettabbli.Jekk le, sib id-disinn tar-reġjun cds tas-sekwenza tad-DNA.
It-tul tal-prodott kwantitattiv fluworexxenti huwa 80-150bp, l-itwal huwa 300bp, it-tul tal-primer ġeneralment ikun bejn 17-25 bażi, u d-differenza bejn il-primers upstream u downstream m'għandhiex tkun kbira wisq.

Il-kontenut G + C huwa bejn 40% u 60%, u 45-55% huwa l-aħjar.
Il-valur TM huwa bejn 58-62 grad.
Ipprova tevita primer dimers u self-dimers, (ma jidhrux aktar minn 4 pari ta 'bażijiet komplementari konsekuttivi) istruttura hairpin, jekk inevitabbli, agħmel ΔG<4.5kJ/mol* Jekk ma tistax tiżgura li l-gDNA tneħħa waqt it-traskrizzjoni inversa Nadif, huwa aħjar li tiddisinja l-primers tal-intron * 3′ tarf biex tevita l-istruttura AT, T-G/C u rich ma tistax tiġi modifikata 3) primers u mhux
speċifika L-omoloġija tas-sekwenza amplifikata b'mod eteroġenu hija preferibbilment inqas minn 70% jew għandha 8 omoloġija bażi komplementari.
Database:
QotonFGD tfittxija bil-kliem kjavi
Disinn tal-primer:
Disinn tal-primer IDT-qPCR

Fig2 IDT online primer disinn għodda paġna

Il-wiri tal-paġna tar-riżultat Fig3
Disinn ta' lncRNA primers:
lncRNA:l-istess passi bħall-mRNA.
miRNA:Il-prinċipju tal-metodu stem-loop: Peress li l-miRNAs kollha huma sekwenzi qosra ta 'madwar 23 nt, skoperta diretta tal-PCR ma tistax titwettaq, għalhekk tintuża l-għodda tas-sekwenza ta' stem-loop.Is-sekwenza stem-loop hija DNA single-stranded ta 'madwar 50 nt, li tista' tifforma struttura hairpin waħedha.3 'It-tarf jista' jiġi ddisinjat bħala sekwenza kumplimentari għall-framment parzjali tal-miRNA, allura l-miRNA fil-mira jista 'jiġi mqabbad mas-sekwenza ta' zokk-loop waqt it-traskrizzjoni inversa, u t-tul totali jista 'jilħaq 70bp, li huwa konformi mat-tul tal-prodott amplifikat determinat mill-qPCR.Tailing miRNA primer disinn.
Sejbien speċifiku għall-amplifikazzjoni:
Database tal-blast onlajn: CottonFGD blast skont is-similarità tas-sekwenza
Blast lokali: Irreferi għall-użu ta 'Blast + biex tagħmel blast lokali, linux u macos jistgħu jistabbilixxu direttament database lokali, is-sistema win10 tista' ssir ukoll wara l-installazzjoni ta 'ubuntu bash.Oħloq database tal-blast lokali u blast lokali;iftaħ ubuntu bash fuq win10.
Avviż: Il-qoton upland u l-qoton tal-gżejjer tal-baħar huma uċuħ tar-raba 'tetraploid, għalhekk ir-riżultat tal-blast ħafna drabi jkun żewġ logħbiet jew aktar.Fil-passat, bl-użu ta ' NAU cds bħala database biex iwettaq blast x'aktarx li jsib żewġ ġeni omologi bi ftit differenzi SNP biss.Normalment, iż-żewġ ġeni omoloġi ma jistgħux jiġu sseparati b'disinn tal-primer, għalhekk huma ttrattati bħala l-istess.Jekk ikun hemm indel ovvju, il-primer huwa ġeneralment iddisinjat fuq l-indel, iżda dan jista 'jwassal għall-istruttura sekondarja tal-primer L-enerġija ħielsa ssir ogħla, li twassal għal tnaqqis fl-effiċjenza tal-amplifikazzjoni, iżda dan huwa inevitabbli.

Sejbien tal-istruttura sekondarja tal-primer:
Passi:iftaħ oligo 7 → sekwenza tal-mudell tad-dħul → agħlaq is-sotto-tieqa → issalva → lokalizzata primer fuq il-mudell, agħfas ctrl+D biex tissettja t-tul tal-primer → tanalizza diversi strutturi sekondarji, bħal korp ta 'awto-dimerizzazzjoni, heterodimer, hairpin, nuqqas ta' qbil, eċċ L-aħħar żewġ stampi fil-Figura 4 huma r-riżultati tat-test tal-primers.Ir-riżultat tal-primer ta 'quddiem huwa tajjeb, m'hemm l-ebda struttura ovvja ta' dimer u hairpin, l-ebda bażijiet komplementari kontinwi, u l-valur assolut tal-enerġija ħielsa huwa inqas minn 4.5, filwaqt li l-primer ta 'wara juri kontinwu Is-6 bażijiet huma komplementari, u l-enerġija ħielsa hija 8.8;barra minn hekk, jidher dimer aktar serju fit-tarf 3′, u jidher dimer ta '4 bażijiet konsekuttivi.Għalkemm l-enerġija ħielsa mhix għolja, id-dimer 3 'Chl jista' jaffettwa serjament l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni.Barra minn hekk, huwa meħtieġ li tiċċekkja għal hairpins, eterodimeri, u diskrepanzi.

Fig3 oligo7 riżultati ta 'skoperta
Sejbien tal-effiċjenza tal-amplifikazzjoni:
L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tar-reazzjoni tal-PCR taffettwa serjament ir-riżultati tal-PCR.Ukoll fil-qRT-PCR, l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija partikolarment importanti għar-riżultati kwantitattivi.Neħħi sustanzi, magni u protokolli oħra fil-buffer tar-reazzjoni.Il-kwalità tal-primers għandha wkoll influwenza kbira fuq l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-qRT-PCR.Sabiex tiġi żgurata l-eżattezza tar-riżultati, kemm il-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza relattiva kif ukoll il-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza assoluta jeħtieġ li jiskopru l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-primers.Huwa rikonoxxut li L-effiċjenza effettiva ta 'amplifikazzjoni qRT-PCR hija bejn 85% u 115%.Hemm żewġ metodi:
1. Metodu tal-kurva standard:
a.Ħallat cDNA
b.Dilwizzjoni tal-gradjent
c.qPCR
d.Ekwazzjoni ta' rigressjoni lineari biex tikkalkula l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni
2. LinRegPCR
LinRegPCR huwa programm għall-analiżi ta 'data RT-PCR f'ħin reali, imsejħa wkoll data PCR kwantitattiva (qPCR) ibbażata fuq SYBR Green jew kimika simili.Il-programm juża data mhux korretta tal-linja bażi, iwettaq korrezzjoni tal-linja bażi fuq kull kampjun Separatament, jiddetermina tieqa ta 'linearità u mbagħad juża analiżi ta' rigressjoni lineari biex taqbel linja dritta permezz tas-sett tad-dejta tal-PCR.Mill-inklinazzjoni ta' din il-linja tiġi kkalkulata l-effiċjenza tal-PCR ta' kull kampjun individwali.L-effiċjenza medja tal-PCR għal kull amplikon u l-valur Ct għal kull kampjun jintużaw biex tiġi kkalkulata konċentrazzjoni tal-bidu għal kull kampjun, espressa f'unitajiet ta' fluworexxenza arbitrarja.Id-dħul u l-ħruġ tad-dejta huma permezz ta’ spreadsheet Excel.Kampjun biss
it-taħlit huwa meħtieġ, l-ebda gradjent
passi huma meħtieġa:(Ħu Bole CFX96 bħala eżempju, mhux pjuttost Magni b'ABI ċar)
esperiment:huwa esperiment qPCR standard.
Output tad-dejta qPCR:LinRegPCR jista 'jirrikonoxxi żewġ forom ta' fajls ta 'output: RDML jew kwantifikazzjoni Riżultat ta' amplifikazzjoni.Fil-fatt, huwa l-valur ta 'skoperta f'ħin reali tan-numru taċ-ċiklu u s-sinjal tal-fluworexxenza mill-magna, u l-amplifikazzjoni tinkiseb billi jiġi analizzat il-valur tal-bidla tal-fluworexxenza tal-effiċjenza tas-segment lineari.
Għażla tad-dejta: Fit-teorija, il-valur RDML għandu jkun użabbli.Huwa stmat li l-problema tal-kompjuter tiegħi hija li s-softwer ma jistax jirrikonoxxi l-RDML, għalhekk għandi l-valur tal-output Excel bħala d-dejta oriġinali.Huwa rakkomandat li twettaq screening approssimattiv tad-dejta l-ewwel, bħall-falliment taż-żieda ta 'kampjuni, eċċ Il-punti jistgħu jitħassru fid-dejta tal-output (naturalment, ma tistax tħassarhom, LinRegPCR se jinjora dawn il-punti fl-istadju aktar tard)

Fig5 qPCR esportazzjoni tad-dejta

Fig6 għażla ta 'kampjuni kandidati

Input tad-dejta:Iftaħ ir-riżultati tal-amplifikazzjoni tal-kwalifika.xls, → tiftaħ LinRegPCR → fajl → aqra minn excel → agħżel il-parametri kif muri fil-Figura 7 → OK → ikklikkja jiddetermina linji bażi

Fig7 passi tad-dħul tad-dejta linRegPCR

Riżultat:Jekk ma jkunx hemm ripetizzjoni, l-ebda grupp ma jkun meħtieġ.Jekk ikun hemm ripetizzjoni, il-grupp jista 'jiġi editjat fil-grupp tal-kampjun, u l-isem tal-ġene jiddaħħal fl-identifikatur, u mbagħad l-istess ġene jiġi raggruppat awtomatikament.Fl-aħħarnett, ikklikkja fuq il-fajl, esporta excel, u ara r-riżultati.L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni u r-riżultati R2 ta 'kull bir se jintwerew.It-tieni nett, jekk taqsam fi gruppi, tintwera l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni medja kkoreġuta.Żgura li l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni ta' kull primer hija bejn 85% u 115%.Jekk huwa kbir wisq jew żgħir wisq, dan ifisser li l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni tal-primer hija fqira.

Fig 8 Riżultat u output tad-dejta

Proċess sperimentali:
Rekwiżiti tal-kwalità tal-RNA:
Purità:1.72.0 jindika li jista 'jkun hemm isothiocyanate residwu.L-aċidu nuklejku nadif A260/A230 għandu jkun ta 'madwar 2 .Jekk ikun hemm assorbiment qawwi f'230 nm, jindika li hemm komposti organiċi bħal joni fenati.Barra minn hekk, jista 'jiġi skopert b'elettroforesi ta' ġel agarose ta '1.5%.Ippunta l-markatur, minħabba li l-ssRNA m'għandu l-ebda denaturazzjoni u l-logaritmu tal-piż molekulari m'għandux relazzjoni lineari, u l-piż molekulari ma jistax jiġi espress b'mod korrett.Konċentrazzjoni: Teoretikamentleinqas minn 100ng/ul, jekk il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq, il-purità hija ġeneralment baxxa mhux tall

Fig9 ġel RNA

Barra minn hekk, jekk il-kampjun huwa prezzjuż u l-konċentrazzjoni ta 'RNA hija għolja, huwa rakkomandat li alikwot wara l-estrazzjoni, u ddilwixxi l-RNA għal konċentrazzjoni finali ta' 100-300ng/ul għal traskrizzjoni inversa.Filil-proċess tat-traskrizzjoni inversa, Meta l-mRNA jiġi traskritt, primers oligo (dt) li jistgħu jingħaqdu speċifikament ma 'dnub polyA jintużaw għal traskrizzjoni inversa, filwaqt li lncRNA u circRNA jużaw primers random hexamer (Random 6 mer) għal traskrizzjoni inversa ta' RNA totali Għal miRNA, primers neck-loop speċifiċi għal miRNA jintużaw għal traskrizzjoni inversa.Ħafna kumpaniji issa nedew kits tailing speċjali.Għall-metodu stem-loop, il-metodu tailing huwa aktar konvenjenti, high-throughput, u li jiffrankaw ir-reaġent, iżda L-effett tad-distinzjoni tal-miRNAs tal-istess familja m'għandux ikun tajjeb daqs il-metodu stem-loop.Kull kit ta 'traskrizzjoni inversa għandu rekwiżiti għall-konċentrazzjoni ta' primers speċifiċi għall-ġeni (stem-loops).Ir-referenza interna użata għall-miRNA hija U6.Fil-proċess ta 'inverżjoni ta' zokk-loop, tubu ta 'U6 għandu jitreġġa' lura separatament, u l-primers ta 'quddiem u ta' wara ta 'U6 għandhom jiżdiedu direttament.Kemm circRNA kif ukoll lncRNA jistgħu jużaw HKGs bħala referenza interna.Filsejbien ta' cDNA,
jekk ma jkunx hemm problema bl-RNA, cDNA għandu wkoll ikun tajjeb.Madankollu, jekk tiġi segwita l-perfezzjoni tal-esperiment, huwa aħjar li tuża ġene ta 'referenza interna (Ġene ta' referenza, RG) li tista 'tiddistingwi gDNA minn cds.Ġeneralment, RG huwa ġene tad-dar., HKG) kif muri fil-Figura 10;Dak iż-żmien, kont qed nagħmel il-proteina tal-ħażna tas-sojja, u użajt actin7 li kien fih introni bħala referenza interna.Id-daqs tal-framment amplifikat ta 'dan il-primer fil-gDNA kien 452bp, u jekk cDNA kien użat bħala mudell, kien 142bp.Imbagħad ir-riżultati tat-test sabu li Parti mis-cDNA kienet attwalment ikkontaminata minn gDNA, u wriet ukoll li ma kien hemm l-ebda problema bir-riżultat tat-traskrizzjoni inversa, u setgħet tintuża bħala mudell għall-PCR.Huwa inutli li tmexxi l-elettroforesi tal-ġel tal-agarose direttament b'cDNA, u hija faxxa mxerrda, li mhix konvinċenti.

Fig 10 sejbien ta' cDNA

Id-determinazzjoni tal-kundizzjonijiet qPCRhuwa ġeneralment l-ebda problema skond il-protokoll tal-kit, prinċipalment fil-pass tal-valur tm.Jekk xi primers mhumiex iddisinjati tajjeb waqt id-disinn tal-primer, li tirriżulta f'differenza kbira bejn il-valur tm u s-60 °C teoretiku, huwa rakkomandat li s-cDNA Wara li l-kampjuni jitħalltu, mexxi gradjent PCR b'primers, u pprova tevita li tissettja t-temperatura mingħajr meded bħala l-valur TM.

Analiżi tad-dejta

Il-metodu ta 'proċessar PCR kwantitattiv ta' fluworexxenza relattiva konvenzjonali huwa bażikament skond 2-ΔΔCT.Mudell għall-ipproċessar tad-dejta.

Prodotti Relatati:

Real Time PCR Easy^TM –Taqman

Real Time PCR Easy^TM –SYBR AĦDAR I

RT Easy I (Master Premix għas-sintesi tal-ewwel linja cDNA)

RT Easy II (Master Premix għas-sinteżi ta' l-ewwel linja ta' cDNA għal qPCR)