COVID-19 hija marda infettiva kkawżata mis-Sindrome Respiratorju Akut Sever Coronavirus Tip 2. Meta persuna tkun infettata, l-aktar sintomi komuni jinkludu deni, sogħla, u qtugħ ta’ nifs.
Il-kampjuni użati għall-ittestjar jistgħu jinġabru minn tampuni nażofarinġi jew tampuni orofarinġi.
Il-metodu standard ta 'skoperta tal-koronavirus huwa reazzjoni katina tal-polimerażi, PCR.Dan huwa metodu użat ħafna fil-bijoloġija molekulari.Jista 'malajr jikkopja miljuni għal biljuni ta' frammenti speċifiċi tad-DNA.
Il-koronavirus il-ġdid fih ġenoma RNA single-stranded twil ħafna.Sabiex jinstabu dawn il-viruses permezz tal-PCR, il-molekuli tal-RNA għandhom jiġu kkonvertiti fis-sekwenzi tad-DNA komplementari tagħhom permezz ta 'reverse transcriptase, u mbagħad id-DNA li għadu kif ġie sintetizzat jista' jiġi amplifikat bi proċeduri standard tal-PCR, li huwa komunement magħruf bħala RT-PCR.
Proċess RT-PCR
Estrazzjoni tal-RNA
Biex twettaq dan il-metodu, l-RNA virali għandu bażikament jiġi estratt.Varjetà ta 'kits ta' purifikazzjoni RNA jistgħu jintużaw għal separazzjoni konvenjenti, veloċi u effettiva.
Biex tiġbed l-RNA virali billi tuża kit kummerċjali, l-ewwel żid il-kampjun ma 'tubu mikroċentrifugu u mbagħad ħallat mal-liżi buffer.Dan il-buffer huwa denaturat ħafna u ġeneralment jikkonsisti minn phenol u guanidine isothiocyanate.Barra minn hekk, l-inibituri ta 'RNase huma ġeneralment preżenti fil-liżi buffer biex jiżguraw iżolament ta' RNA virali intatt.
Wara li żżid il-liżi buffer, ħawwad it-tubu tat-taħlit bil-polz u inkuba f'temperatura tal-kamra.Il-virus imbagħad jiġi lisat taħt kundizzjonijiet ta' denaturazzjoni ħafna pprovduti mill-liżi buffer.
Wara li l-kampjun ikun lysed, tubu ċentrifugu jintuża għall-proċedura ta 'purifikazzjoni.Il-kampjun jitgħabba fit-tubu taċ-ċentrifuga u mbagħad jiġi ċentrifugat.
Din il-proċedura hija metodu ta 'estrazzjoni ta' fażi solida li fiha l-fażi stazzjonarja tikkonsisti minn matriċi tal-ġel tas-silika.
Taħt l-aħjar kundizzjonijiet tal-melħ u tal-pH, il-molekuli tal-RNA jingħaqdu mal-membrana tas-silika.
Fl-istess ħin, il-proteini u kontaminanti oħra jitneħħew.
Wara ċ-ċentrifugazzjoni, poġġi t-tubu taċ-ċentrifuga f'tubu tal-ġbir nadif, armi l-filtrat, u mbagħad żid buffer tal-ħasil.
Erġa' poġġi t-tubu fiċ-ċentrifuga biex iġġiegħel il-wash buffer minn ġol-membrana.Dan se jneħħi l-impuritajiet kollha li jifdal mill-membrana, u jħalli biss l-RNA marbut mal-ġel tas-silika.
Wara li l-kampjun jinħasel, poġġi t-tubu ġo tubu mikroċentrifugu nadif u żid il-buffer tal-eluzzjoni.
Imbagħad jiġi ċentrifugat biex iġġiegħel il-buffer tal-eluzzjoni minn ġol-membrana.Il-buffer tal-eluzzjoni jneħħi l-RNA virali mill-kolonna spin u jikseb RNA purifikat ħieles minn proteini, inibituri, u kontaminanti oħra.
Konċentrat imħallat
Wara l-estrazzjoni tal-RNA virali, il-pass li jmiss huwa li tipprepara t-taħlita ta 'reazzjoni għall-amplifikazzjoni tal-PCR.F'dan il-pass, jintuża konċentrat.Din is-soluzzjoni kkonċentrata hija soluzzjoni kkonċentrata mħallta minn qabel li tikkonsisti minn taħlita minn qabel, reverse transcriptase, nukleotidi, forward primer, reverse primer, sonda TaqMan u DNA polymerase.
Fl-aħħarnett, biex tlesti din it-taħlita ta 'reazzjoni, il-mudell RNA huwa miżjud.It-tubi jitħalltu permezz ta 'vortexing tal-polz, u mbagħad it-taħlita ta' reazzjoni titgħabba fil-pjanċa tal-PCR.Il-pjanċa tal-PCR normalment fiha 96 bjar u tista 'tanalizza kampjuni multipli fl-istess ħin.
Amplifikazzjoni tal-PCR
Sussegwentement, poġġi l-pjanċa fil-magna PCR, li essenzjalment hija ċiklatur termali.
L-RT-PCR f'ħin reali jintuża biex jiskopri l-koronavirus ġdid tal-2019 billi jamplifika s-sekwenza fil-mira fil-ġene RdrRP, il-ġene E u l-ġene N.L-għażla tal-ġene fil-mira tiddependi fuq is-sekwenza tal-primer u tas-sonda.
L-ewwel pass ta 'RT-PCR huwa traskrizzjoni inversa.L-ewwel linja ta 'DNA komplementari hija sintetizzata, li tinbeda mill-primer reverse PCR, li jorbot mal-parti komplementari tal-ġenoma tal-RNA virali.Imbagħad reverse transcriptase iżid nukleotidi tad-DNA mat-3′tarf tal-primer biex jissintetizza DNA kumplimentari għall-RNA virali.It-temperatura u t-tul ta' dan il-pass jiddependu fuq il-primers, l-RNA fil-mira, u t-transcriptase inversa użati.
Sussegwentement, jiġi applikat pass inizjali ta 'denaturazzjoni, li jirriżulta fid-denaturazzjoni tal-ibridu RNA-DNA.Dan il-pass huwa meħtieġ biex tiġi attivata d-DNA polymerase.Fl-istess ħin, reverse transcriptase hija inattivata.
Il-PCR jikkonsisti f'serje ta' ċikli termali.Kull ċiklu jikkonsisti f'passi ta' denaturazzjoni, ittemprar u estensjoni.
Il-pass tad-denaturazzjoni jinvolvi t-tisħin tal-kamra tar-reazzjoni għal 95 grad Celsius u l-użu tagħha għad-denaturazzjoni tal-mudell tad-DNA b'strand doppju.
Fil-pass li jmiss, it-temperatura tar-reazzjoni titnaqqas għal 58 grad Celsius, li tippermetti li l-primer quddiem jittempra mal-parti kumplimentari tal-mudell tad-DNA single-stranded tiegħu.It-temperatura ta 'l-ittemprar tiddependi direttament fuq it-tul u l-kompożizzjoni tal-primer.
Fil-pass ta' estensjoni, id-DNA polymerase tisintetizza linja tad-DNA ġdida li hija komplementari għall-linja tal-mudell tad-DNA.Billi żżid nuklei ħielsa komplementari għall-mudell fid-direzzjoni 5′sa 3′ mit-taħlita ta 'reazzjoni.It-temperatura ta 'dan il-pass tiddependi fuq il-polimerażi tad-DNA użata.
Wara l-ewwel ċiklu, tinkiseb mira tad-DNA double-stranded.
Imbagħad, daħħal it-tieni ċiklu.Id-DNA double-stranded jiġi żnaturat biex jipproduċi żewġ molekuli tad-DNA single-stranded.
Fil-pass li jmiss, it-temperatura tar-reazzjoni titbaxxa, il-primers huma temprat għal kull mudell tad-DNA single-stranded, u s-sonda Taq-man tittempra mal-parti kumplimentari tad-DNA fil-mira.
Is-sonda TaqMan tikkonsisti minn fluworoforu marbut b'mod kovalenti mat-tarf 5' tas-sonda oligonukleotide.Meta eċċitati mis-sors tad-dawl taċ-ċiklatur, il-fluworoforu jarmi fluworexxenza.Barra minn hekk, is-sonda hija magħmula minn quencher fit-3′end.Il-prossimità tal-ġene reporter għall-quencher tipprevjeni l-iskoperta tal-fluworexxenza.
Fil-pass ta 'estensjoni, il-polimerażi tad-DNA tissintetizza linja ġdida.Meta l-polimerażi tilħaq is-sonda TaqMan, l-attività endoġena tagħha ta '5'nukleażi tqatta' s-sonda, tissepara ż-żebgħa mill-quencher.
Ma 'kull ċiklu ta' PCR, aktar molekuli taż-żebgħa jiġu rilaxxati, li jirriżultaw f'żieda fl-intensità tal-fluworexxenza proporzjonali għan-numru ta 'amplicons sintetizzati.
Dan il-metodu jippermetti li jiġi stmat in-numru ta' sekwenza partikolari preżenti fil-kampjun.In-numru ta 'frammenti tad-DNA double-stranded jirdoppja f'kull ċiklu.Għalhekk, il-PCR jista 'jintuża biex janalizza kampjuni żgħar ħafna.
Għall-kejl ta 'sinjal fluworexxenti, fanal aloġenu tat-tungstenu, filtru ta' eċċitazzjoni, riflettur, lenti, filtru ta 'emissjoni u kamera CCD ta' apparat akkoppjat ma 'ċarġ.
PASS 4 Individwaw
Għall-kejl ta 'sinjal fluworexxenti, fanal aloġenu tat-tungstenu, filtru ta' eċċitazzjoni, riflettur, lenti, filtru ta 'emissjoni u kamera CCD ta' apparat akkoppjat ma 'ċarġ.
Id-dawl iffiltrat mill-lampa huwa rifless mir-riflettur, jgħaddi mill-lenti tal-kondensatur, u huwa ffukat lejn iċ-ċentru ta 'kull toqba.Imbagħad il-fluworexxenza emessa mit-toqba hija riflessa mill-mera, tgħaddi mill-filtru tal-emissjoni, u tiġi skoperta mill-kamera CCD.F'kull ċiklu tal-PCR, id-dawl tal-fluworoforu awto-eċċitat jista 'jiġi skopert mill-CCD.
Jikkonverti d-dawl maqbud f'dejta diġitali.Dan il-metodu jissejjaħ PCR f'ħin reali, u jippermetti monitoraġġ f'ħin reali tal-progress tar-reazzjoni tal-PCR.
Ħin tal-post: Lulju-19-2021