PCR, multipli PCR, PCR in situ, Reverse PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Aħna ser issolvi l-kunċetti, il-passi u d-dettalji ta 'diversi PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, imsejħa PCR, hija teknoloġija bijoloġika molekulari li tintuża biex tkabbar frammenti speċifiċi tad-DNA.Jista' jitqies bħala replikazzjoni speċjali tad-DNA in vitro.DNA polimerażi (DNA Polymerase I) ġiet skoperta kmieni kemm fl-1955, u Klenow Fragment ta 'E. Coli, li għandu valur sperimentali u prattiċità, ġie skopert minn Dr H. Klenow fil-bidu tas-snin 70, iżda minħabba li din l-enzima ma tittollerax temperatura, temperatura għolja tista' tiddiġeneraha, u għalhekk ma tissodisfax ir-reazzjoni ta 'katina ta' polimerażi għolja.L-enzimi li qed jintużaw illum (imsejħa Taq polymerase), ġew iżolati minn Thermus aquaticus, batterju tar-rebbiegħa sħun fl-1976. Il-karatteristika tiegħu hija li tista 'tirreżisti temperatura għolja u hija enzima ideali, iżda tintuża ħafna wara t-tmeninijiet.Il-kunċett oriġinali tal-prototip primittiv oriġinali tal-PCR huwa simili għat-tiswija u l-ikkupjar tal-ġeni, li ġie propost minn Dr KJell Kleppe fl-1971. Huwa ppubblika l-ewwel kopja tal-ġeni sempliċi u għal żmien qasir (simili għall-ewwel żewġ reazzjonijiet taċ-ċiklu tal-PCR).Il-PCR żviluppat illum ġie żviluppat minn Dr Kary B. Mullis fl-1983. Dr Mullis serva kumpaniji PE dik is-sena, għalhekk PE għandu status speċjali fl-industrija tal-PCR.Dr Mullis uffiċjalment ippubblika l-ewwel karta relatata ma 'Saiki u oħrajn fl-1985. Minn dakinhar, l-użu ta' PCR huwa eluf ta 'mili kuljum, u l-kwalità ta' karti relatati tista 'tingħad li tagħmel ħafna metodi oħra ta' riċerka mhux palatabbli.Sussegwentement, it-teknoloġija PCR tintuża ħafna fir-riċerka xjentifika bijoloġika u l-applikazzjonijiet kliniċi, u ssir l-aktar teknoloġija importanti tar-riċerka tal-bijoloġija molekulari.Mullis rebaħ ukoll il-Premju Nobel tal-Kimika fl-1993.

PCRPrinċipju

Il-prinċipju bażiku tat-teknoloġija tal-PCR huwa simili għall-proċess ta 'replikazzjoni naturali tad-DNA, u l-ispeċifiċità tiegħu tiddependi fuq il-primer tal-oligonucleotide li huwa komplementari għaż-żewġt itruf tas-sekwenza fil-mira.PCR huwa magħmul minn deġenerazzjoni-ittemprar-estensjoni tliet passi ta 'reazzjonijiet bażiċi: ①Deġenerazzjoni tad-DNA mudell: Wara li d-DNA mudell jissaħħan għal madwar 93 ° C għal ċertu perjodu ta' żmien, is-soluzzjoni tad-DNA doppja għad-DNA b'katina doppja ffurmata mill-amplifikazzjoni PCR tad-DNA mudell Leaving, għamilha katina waħda biex ir-reazzjoni li jmiss tkun tista 'tiġi kkombinata mal-primer round.②L-ittemprar (kompost) tad-DNA tal-mudell u l-primer: Wara li d-DNA tal-mudell jissaħħan u jiġi deġenerat f'katina waħda, it-temperatura tinżel għal madwar 55 °C.Is-sekwenza komplementari tal-primer u l-mudell DNA single-chain.③L-estensjoni tal-primer: mudell tad-DNA-l-irbit tal-primer huwa bbażat fuq l-azzjoni ta 'TaqDNA polymerase, bid-dNTP bħala l-materja prima tar-reazzjoni.Żomm il-prinċipju ta 'replikazzjoni, sintetizza katina ta' kopja semi-riżervata ġdida li tikkumplimenta l-katina tad-DNA tal-mudell, u rrepeti ċiklu ta 'deġenerazzjoni-ittemprar-estensjoni tliet proċessi jistgħu jiksbu aktar "katina ta' kopja semi-riservata", u din il-katina ġdida hija disponibbli għal darb'oħra Issir mudell għaċ-ċiklu li jmiss.Huwa jieħu 2-4min biex jitlesta l-linja, il-ġene fil-mira jista 'jiġi amplifikat bosta miljuni ta' darba f'2-3 sigħat.

StandardPCRSistema ta' Reazzjoni

Ħames elementi ta 'reazzjoni PCR

Hemm prinċipalment ħames tipi ta 'sustanzi involuti fir-reazzjoni tal-PCR, jiġifieri primer, enżima, dNTP, template u buffer (Mg2+ huwa meħtieġ).[Proċedura PCR]

Il-proċess standard tal-PCR huwa maqsum fi tliet passi

1. Deġenerazzjoni tad-DNA (90°C-96°C): Mudelli tad-DNA b'katina doppja taħt azzjoni termali, il-bonds tal-idroġenu jinkisru, u jiffurmaw DNA b'katina waħda.

2. Ittemprar (25℃ -65℃): It-temperatura tas-sistema titnaqqas, il-primer huwa kkombinat mal-mudell tad-DNA biex jifforma katina doppja lokali.

3. Estensjoni (70℃ -75℃): Taħt l-azzjoni tal-enzima Taq (madwar 72 °C, l-aħjar attività), dNTP jintuża bħala l-materja prima, testendi mit-tarf 5′ tal-primer → tarf 3′, sinteżi u template jikkumplimentaw lil xulxin katina tad-DNA.

Kull ċiklu huwa żnaturat, ittemprat u estiż, u jirdoppja l-kontenut tad-DNA.Fil-preżent, minħabba ż-żona qasira ta 'amplifikazzjoni, xi PCR jistgħu jiġu replikati fi żmien qasir ħafna anke jekk l-attività ta' l-enżima Taq mhix ottimali, għalhekk tista 'tinbidel għal żewġ passi, jiġifieri, l-ittemprar u l-estensjoni jistgħu jitwettqu f'60 ° C-65 ° C fl-istess ħin.Sabiex jitnaqqas il-proċess ta 'rfigħ u tkessiħ u tittejjeb il-veloċità tar-rispons.

Karatteristiċi tar-Reazzjoni PCR

● Speċifikazzjoni Għolja

Il-fatturi deċiżivi speċifiċi tar-rispons tal-PCR huma: ①Il-kombinazzjoni speċifika tal-primer u t-template DNA.②Il-prinċipju tat-tqabbil tal-bażi.③Il-lealtà tar-reazzjoni tas-sinteżi tal-polimerażi TaqDNA.④L-ispeċifiċità u l-konservattività tal-ġene fil-mira.

Il-kombinazzjoni korretta ta 'primers u mudelli hija ċ-ċavetta.L-irbit tal-primer u l-mudell u l-estensjoni tal-katina tal-primer huma bbażati fuq il-prinċipju tat-tqabbil tal-bażi alkalina.Il-lealtà tar-reazzjonijiet ta 'sintesi tal-polimerażi u r-reżistenza għat-temperatura għolja tat-Taq DNA polymerase biex tagħmel l-irbit (kompost) tal-mudell u l-primer fir-reazzjoni jistgħu jitwettqu f'temperatura ogħla.L-ispeċifiċità tal-kombinazzjoni tiżdied ħafna.Il-klipp jista 'jżomm grad għoli ta' korrettezza.Billi tagħżel reġjun ġenetiku fil-mira b'konservattività għolja u konservattività għolja, l-ispeċifiċità tiegħu hija ogħla.

● Sensittività Għolja

Il-volum tal-produzzjoni tal-prodotti tal-PCR jiżdied b'indiċi, li jista 'jespandi l-mudell tal-bidu ta' Picker (PG=10-12) biex iżid il-livell ta 'mikrokontrollur għal-livell ta' mikrogrammi (μg= -6).Ċelloli fil-mira jistgħu jiġu skoperti minn miljun ċellula;fl-iskoperta ta 'viruses, is-sensittività tal-PCR tista' tilħaq 3 RFUs (spots vojta ffurmati unitajiet);ir-rata minima ta 'skoperta fix-xjenza tal-batterja hija ta' 3 batterji.

● Sempliċi u Mgħaġġla

Ir-riflessjoni tal-PCR tuża polimerażi tad-DNA Taq ta 'temperatura għolja, li żżid is-soluzzjoni ta' reazzjoni f'ħin wieħed, jiġifieri, reazzjoni ta 'deġenerazzjoni-anneal-estensjoni fuq is-soluzzjoni ta' amplifikazzjoni tad-DNA u pot tal-banju tal-ilma.Ġeneralment, ir-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni titlesta f'2 sa 4 sigħat.Prodotti miżjuda huma ġeneralment analizzati minn xabla elettrika, u m'għandhomx għalfejn jużaw iżotopi, l-ebda tniġġis radjuattiv, u promozzjoni faċli.

● Il-purità tal-kampjun hija baxxa

M'hemmx bżonn li tissepara viruses jew batterji u ċelloli tal-kultura.Prodotti mhux raffinati tad-DNA u RNA jistgħu jintużaw bħala amplifikaturi.L-iskoperta tal-amplifikazzjoni tad-DNA tista 'tintuża direttament bl-użu ta' kampjuni kliniċi bħal demm, likwidu tal-ġisem, fluwidu tal-ħasil tas-sogħla, xagħar, ċelluli u tessut ħaj.

PCRproblemi komuni

● Negattiv falz, l-ebda meded amplifikat

L-istadji ewlenin tar-reazzjoni tal-PCR jinkludu: ① preparazzjoni ta 'aċidi nuklejċi template, ② kwalità u speċifiċità tal-primers, ③ il-kwalità tal-enzimi ④ kundizzjonijiet taċ-ċiklu tal-PCR.Is-sejba tar-raġuni għandha tiġi analizzata u studjata wkoll għar-rabtiet ta 'hawn fuq.

Mudelli: ① Il-mudell fih proteina mixxellanja, ② Il-mudell fih inibitur tal-enzima Taq, ③ Il-proteina fil-mudell mhix eliminata, speċjalment il-proteina tal-grupp fil-kromożoma.⑤ Id-deġenerazzjoni tal-aċidu nuklejku tad-Deminer mhix bir-reqqa.Meta l-kwalità ta 'enżimi u primers huma tajba, m'hemm l-ebda faxxa ta' amplifikazzjoni, li x'aktarx hija t-trattament diġestiv ta 'kampjuni.Hemm xi ħaġa ħażina fil-proċess ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku tal-mudell, għalhekk biex tipprepara soluzzjoni ta 'diġestjoni effettiva u stabbli, il-proċedura tagħha għandha tiġi ffissata u mhux mibdula b'mod arbitrarju.

Inattivazzjoni tal-enzimi: enzima ġdida jew kemm enzimi qodma kif ukoll ġodda għandhom jintużaw flimkien biex janalizzaw jekk l-attività tal-enzima hijiex mitlufa jew insuffiċjenti, li twassal għal negattivi foloz.Għandu jiġi nnutat li l-enzima Taq jew il-bromur tal-ethidium xi drabi jintesa.

Primer: il-kwalità tal-primer, il-konċentrazzjoni tal-primer, u jekk il-konċentrazzjoni taż-żewġ primers hijiex simetrika.Hija raġuni komuni għall-falliment tal-PCR jew il-faxxa li qed tiżdied mhix ideali u suxxettibbli li tinfirex.Hemm problemi bil-kwalità tal-primers ta 'xi numri tal-lott.Iż-żewġ primers għandhom konċentrazzjoni għolja u konċentrazzjoni baxxa, li jikkawżaw amplifikazzjoni asimmetrika b'effiċjenza baxxa.Il-kontromiżuri huma: ① Agħżel primer tajjeb biex tisintetizza l-unitajiet.② Il-konċentrazzjoni tal-primer mhux biss tiddependi fuq il-valur OD, iżda wkoll tagħti attenzjoni lill-likwidu oriġinali tal-primer biex tagħmel elettroforesi tal-ġel taz-zokkor tal-agar.Għandu jkun hemm żona ta 'strixxa tal-primer, u l-luminożità taż-żewġ primers għandha tkun ġeneralment konsistenti.Belt, PCR jista 'jfalli f'dan il-ħin, u għandu jiġi solvut bl-unità ta' sinteżi tal-primer.Jekk primer huwa għoli, il-luminożità hija baxxa, u l-konċentrazzjoni tagħha għandha tkun ibbilanċjata meta tiġi dilwita.③ Il-primer għandu jitħallas u jinħażen f'konċentrazzjoni għolja biex jipprevjeni ffriżar multiplu jew partijiet ta 'refriġerazzjoni fit-tul tal-friġġ, li jikkawżaw li l-primer jiddeterjora u jiddegrada.④ Id-disinn tal-primer mhuwiex raġonevoli, bħat-tul tal-primer huwa insuffiċjenti, u d-di cluster huwa ffurmat bejn il-primers.

Mg2 + konċentrazzjoni: Mg2 + konċentrazzjoni tal-jone għandha impatt kbir fuq l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR.Konċentrazzjoni eċċessiva tista 'tnaqqas is-sess oppost tal-amplifikazzjoni tal-PCR.Jekk il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq, l-output tal-amplifikazzjoni tal-PCR saħansitra jagħmel il-falliment tal-amplifikazzjoni tal-PCR mingħajr il-medda ta 'espansjoni.

Bidla fil-volum tar-reazzjoni: Il-volum użat fl-amplifikazzjoni tal-PCR huwa 20ul, 30ul, u 50ul jew 100uL, il-volum kbir tal-applikazzjoni għall-amplifikazzjoni tal-PCR huwa stabbilit skont skopijiet differenti ta 'riċerka xjentifika u ttestjar kliniku.Wara li tagħmel volumi żgħar bħal 20ul, huwa meħtieġ li tagħmel kundizzjoni tal-korda meta tagħmel id-daqs, inkella tfalli.

Raġunijiet fiżiċi: It-trasformazzjoni hija importanti ħafna għall-amplifikazzjoni tal-PCR.Jekk it-temperatura ta 'deġenerazzjoni hija baxxa, il-ħin ta' deġenerazzjoni huwa qasir, x'aktarx li jseħħ f'negattivi foloz;temperatura ta 'ttemprar baxxa wisq tista' tikkawża amplifikazzjoni mhux speċifika u tnaqqas l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni speċifika.Affettwa ħafna l-kombinazzjoni ta 'primers u mudelli biex titnaqqas l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR.Xi drabi huwa meħtieġ li tuża termometri standard biex tiskopri l-varjabbiltà, it-tempra u t-temperatura estiża fl-estensjoni jew il-cooker li jinħall fl-ilma, li hija waħda mir-raġunijiet għall-falliment tal-PCR.

Varjanti tas-sekwenza fil-mira: Jekk isseħħ is-sekwenza fil-mira, mutazzjoni jew tħassir, il-kombinazzjoni tal-prototip u l-mudell hija magħquda, jew minħabba n-nuqqas ta 'sekwenza fil-mira, il-primer u l-mudell se jitilfu s-sekwenza komplementari, u l-amplifikazzjoni tal-PCR tagħha ma tirnexxix.

● Pożittiv falz

Il-medda ta 'amplifikazzjoni tal-PCR tidher konsistenti mal-medda tas-sekwenza fil-mira, u xi drabi l-medda tagħha hija aktar pulita u ogħla.

Id-disinn tal-primer mhuwiex xieraq: is-sekwenza ta 'amplifikazzjoni magħżula u s-sekwenza ta' amplifikazzjoni mhux għal skopijiet għandhom omologu, għalhekk meta l-amplifikazzjoni tal-PCR, il-prodotti tal-PCR amplifikati huma sekwenzi mhux bi skop.Is-sekwenza fil-mira hija qasira wisq jew il-primer huwa qasir wisq, u huwa suxxettibbli għal pożittiv falz.Jeħtieġ li jiġi ddisinjat mill-ġdid.

Tniġġis inkroċjat ta 'sekwenza fil-mira jew prodotti ta' amplifikazzjoni: Hemm żewġ raġunijiet għal dan it-tniġġis: L-ewwel, tniġġis inkroċjat tal-ġenoma kollu jew ta 'segmenti kbar, li jwassal għal pożittivi foloz.Dan it-tip ta 'pożittiv falz jista' jiġi solvut bil-metodi li ġejjin: Oqgħod attent u ġentili waqt it-tħaddim biex tevita li s-sekwenza fil-mira tinġibed man-nifs fil-pistola tal-kampjun jew titlaq mit-tubu ċentrifugali.Ħlief għal enzimi u sustanzi li ma jistgħux jifilħu temperaturi għoljin, ir-reaġenti jew it-tagħmir kollu għandhom jiġu diżinfettati bi pressjoni għolja.Il-pajpijiet ċentrifugali u l-kampjuni għandhom jintużaw f'ħin wieħed.Meta meħtieġ, qabel ma żżid kampjuni, it-tubu tar-reazzjoni u r-reaġent huma esposti għal raġġi ultravjola biex jeqirdu l-aċidu nuklejku eżistenti.It-tieni, frammenti żgħar fit-tniġġis tal-arja.Dawn il-frammenti żgħar huma iqsar mis-sekwenza fil-mira, iżda għandhom ċerta omoloġija.Jista 'jiġi spliced ​​ma' xulxin.Wara li tikkumplimenta l-primers, il-prodott PCR jista 'jiġi estiż, li jikkawża produzzjoni pożittiva falza.Jista 'jintuża biex jitnaqqas jew jiġi eliminat il-metodu PCR tal-bejta.

● Jidhru faxxa ta 'amplifikazzjoni mhux speċifika

Il-meded li dehru wara l-amplifikazzjoni tal-PCR huma inkonsistenti mad-daqs mistenni, jew kbar jew żgħar, jew fl-istess ħin, jew fl-istess ħin, meded speċifiċi ta 'amplifikazzjoni u meded ta' amplifikazzjoni mhux speċifiċi.L-emerġenza ta 'meded mhux speċifiċi hija: L-ewwel, il-primers huma komplementari komplementari għas-sekwenza fil-mira, jew il-polimerizzazzjoni tal-primer biex jiffurmaw di cluster.It-tieni hija li l-konċentrazzjoni ta 'MG2 + ions hija għolja wisq, it-temperatura ta' l-ittemprar hija baxxa wisq, u n-numru ta 'ċikli PCR huwa relatat.It-tieni nett, il-kwalità u l-ammont ta 'enzimi.Ħafna drabi, l-enzimi ta 'xi sorsi huma suxxettibbli għal meded mhux speċjali u l-enzimi tas-sors l-ieħor ma jseħħux.Xi drabi sseħħ ukoll amplifikazzjoni mhux speċifika tal-enzimi.Il-kontromiżuri huma: attraenti ddisinjati mill-ġdid jekk meħtieġ.Naqqas l-ammont ta 'enżima jew ibdel l-enzima ta' sors ieħor.Naqqas l-ammont ta 'primarja, żid l-ammont ta' mudelli b'mod xieraq, u naqqas in-numru ta 'ċikli.Żid sew it-temperatura ta 'l-ittemprar jew uża l-metodu ta' żewġ punti ta 'temperatura (deġenerazzjoni ta' 93 °C, ittemprar u testendi f'madwar 65 °C).

● Jidher stoppa flaky jew tejp smear

L-amplifikazzjoni tal-PCR kultant tidher li tiġi applikata jew imqaxxra jew ċinturin bħal tapit.Għar-raġuni, minħabba l-ammont eċċessiv ta 'enżimi jew il-kwalità fqira tal-enzima, il-konċentrazzjoni dNTP hija għolja wisq, il-konċentrazzjoni Mg2 + hija għolja wisq, it-temperatura tal-ittemprar hija baxxa wisq, u n-numru ta' ċikli huwa wisq.Il-kontromiżuri huma: ①Naqqas l-ammont ta 'enzimi, jew ibdel l-enzima ta' sors ieħor.②Naqqas il-konċentrazzjoni ta 'dNTP ③Naqqas sew il-konċentrazzjoni ta' Mg2+.④Iżżid il-kwantità ta 'mudelli u tnaqqas in-numru ta' ċikli.

Prodotti Relatati

PCR Heroᵀᴹ (Biż-Żebgħa)

◮ Fedeltà ogħla: 6 darbiet dik tal-enzima Taq ordinarja;

◮ Veloċità ta 'amplifikazzjoni aktar mgħaġġla

◮ Aktar adattabilità tal-mudell

◮ Effiċjenza ta 'amplifikazzjoni ogħla

◮ It-tolleranza ambjentali hija aktar b'saħħitha: imqiegħda f'37 ° C għal ġimgħa, iżżomm aktar minn 90% attività;

◮ Għandu 5'→3' DNA polymerase attività u 5'→3' exonuclease attività, mingħajr attività 3'→5' exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (Biż-Żebgħa)

Is-sistema ta 'reazzjoni unika u Taq DNA Polymerase ta' effiċjenza għolja jagħmlu r-reazzjoni tal-PCR ikollha effiċjenza, speċifiċità u sensittività ta 'amplifikazzjoni ogħla.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Pass Wieħed)-SYBR Green I

◮ Kit ta 'pass wieħed jagħmel traskrizzjoni inversa u qPCR żewġ reazzjonijiet fl-istess tubu, jeħtieġ biss li żżid RNA template, primers PCR speċifiċi u ddH Ħieles minn RNase₂O.

◮ Il-kit jista' janalizza b'mod kwantitattiv malajr u effiċjenti RNA virali jew traċċa RNA.

◮ Il-kit juża reaġent tat-traskrizzjoni inversa Foregene uniku u Foregene HotStar Taq DNA Polymerase flimkien ma 'sistema ta' reazzjoni unika biex ittejjeb b'mod effettiv l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni u l-ispeċifiċità tar-reazzjoni.

◮ Is-sistema ta 'reazzjoni ottimizzata tagħmel ir-reazzjoni jkollha sensittività ta' skoperta ogħla, stabbiltà termali aktar b'saħħitha, u tolleranza aħjar.

◮ RT-qPCR Easy^TM(Pass wieħed) -Kit SYBR Green I jiġi ma 'żebgħa ta' referenza interna ROX, li tista 'tintuża biex telimina l-isfond tas-sinjali u l-iżbalji tas-sinjali bejn il-bjar, li huwa konvenjenti għall-klijenti li jużaw f'mudelli differenti ta' strumenti PCR kwantitattivi.

RT Faċli^TMII (Master Premix għal sinteżi cDNA tal-ewwel fergħa għalPCR f'ħin reali)

-Kapaċità effiċjenti biex tneħħi l-gDNA, li tista 'tneħħi l-gDNA fil-mudell fi żmien 2 minuti.

-Sistema effiċjenti ta 'traskrizzjoni inversa, tieħu biss 15-il minuta biex tlesti s-sintesi tal-ewwel linja cDNA.

-Mudelli kumplessi: mudelli b'kontenut għoli ta 'GC u struttura sekondarja kumplessa jistgħu wkoll jitreġġgħu lura b'effiċjenza għolja.

-Sistema ta 'traskrizzjoni inversa ta' sensittività għolja, mudelli ta 'livell pg jistgħu wkoll jiksbu cDNA ta' kwalità għolja.

-Is-sistema ta 'traskrizzjoni inversa għandha stabbiltà termali għolja, l-aħjar temperatura ta' reazzjoni hija 42 ℃, u għad għandha prestazzjoni tajba ta 'traskrizzjoni inversa f'50 ℃.