• facebook
  • linkedin
  • youtube

RT-qPCR huwa l-esperiment bażiku tal-bijoloġija molekulari, u kulħadd għandu jkun familjari miegħu.Prinċipalment jinkludi tliet passi: estrazzjoni ta 'RNA, traskrizzjoni inversa f'cDNA, u PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali.Ma jgħinx, x'qed jiġri?Huwa probabbli li hemm problema bill-esperiment tat-traskrizzjoni inversa!Għalkemm jidher li l-esperiment ta 'traskrizzjoni inversa jeħtieġ biss li żżid RNA, dNTP, primers, ureverse transcriptasegħat-tubu taċ-ċentrifuga u ħawwad sew, iżda fil-proċess ta 'tħaddim attwali, għad hemm ħafna dettalji li jeħtieġ li tingħata attenzjoni għalihom.Ejja nitgħallmu dwarha!

Kif tiġġudika l-kwalità tal-RNA?
Biex tikseb cDNA, il-kwalità tal-RNA hija kritika!Il-kwalità tal-RNA tista' tiġi skoperta prinċipalment minn żewġ aspetti:
(1) Integrità tal-RNA:L-integrità tal-RNA tista 'tiġi vverifikata bl-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose. Meta tieħu ewkarjoti bħala eżempju, l-RNA totali komplet għandu tliet meded ċari, il-piżijiet molekulari minn kbar għal żgħar huma 28S, 18S, u 5S, u 28S huwa darbtejn qawwi daqs 18S;jekk jistgħu jidhru tliet faxex, iżda t-tip ta 'faxxa hija mċajpra jew Diffusion tfisser li l-RNA huwa parzjalment degradat.F'dan iż-żmien, jekk jogħġbok wettaq ir-reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa immedjatament u żid l-input tal-mudell b'mod xieraq;jekk biss faxxa b'piż molekulari żgħir jew l-ebda faxxa ma tista 'tidher, l-RNA ġie degradat kompletament u jeħtieġ li jerġa' jiġi estratt.Agilent 2100 jindika l-integrità tal-RNA b'dijagramma tal-quċċata u l-valur RIN.Jekk l-aċidu nuklejku huwa intatt, il-linja bażi tal-elettroferogramma hija ċatta;jekk l-aċidu nuklejku huwa degradat ħafna, il-linja bażi hija irregolari u jidhru aktar qċaċet ta 'degradazzjoni;il-valur ta 'RIN jirrifletti l-integrità tal-RNA, fil-medda ta' 0-10, iktar ma jkun kbir il-valur, aħjar tkun il-kwalità tal-RNA.Ukoll, iktar ikun għoli l-grad ta 'kompletezza.
(2) Purità tal-RNA:Il-proporzjon ta 'OD260/280 jista' jiġi skopert mill-ispettrofotometrija UV.Jekk il-proporzjon ta 'OD260/280 huwa bejn 1.9 u 2.1, il-purità hija tajba ħafna.
Id-DNA ġenomika residwa tista' twassal għal riżultati kwantitattivi mhux preċiżi
Meta l-RNA jiġi estratt, l-RNA li nġibu jista 'jitħallat ma' DNA ġenomic (gDNA) li ma jkunx ġie mnaddaf.Għalhekk, is-cDNA wara t-traskrizzjoni inversa se jkun imħallat ukollgDNA.Matul il-downstreamqPCRreazzjoni,cDNAu gDNA jista 'jiġi amplifikat simultanjament, li jirriżulta f'valur CT relattivament żgħir, għalhekk ir-riżultati jistgħu jkunu preġudikati.
Allura x’għandna nagħmlu f’din is-sitwazzjoni?Foregenejissuġġerixxi:
(1) Wettaq tindif tal-ġenoma fuq l-RNA maqlub, li jista 'jitneħħa bl-estrazzjoni tal-kolonna waqt l-estrazzjoni tal-RNA;
(2) Ittratta l-RNA estratt b'DNaseI , iżda ittemmha b'EDTA;
tar-reaġenti tat-traskrizzjoni inversab'moduli tal-ikklerjar tal-ġenoma;

Kif tagħżel primers għat-traskrizzjoni inversa?
Primers ta 'traskrizzjoni inversa jaffettwa wkoll ir-riżultat tar-reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa.Tista 'tagħżel primers każwali, Oligo dT jew primers speċifiċi għall-ġeni għal traskrizzjoni inversa skont iċ-ċirkostanzi speċifiċi tal-esperiment:
(1) Traskrizzjonijiet speċifiċi: primers speċifiċi għall-ġeni huma rakkomandati;
(2) Traskrizzjonijiet tal-frammenti twal: Oligo dT/primers speċifiċi għall-ġeni huma rakkomandati;
(3) Frammenti interni ta 'traskrizzjonijiet ta' segmenti twal: primers speċifiċi għall-ġeni/ primers każwali / primers każwali + Oligo dT.Jekk jitwettaq l-esperiment qPCR sussegwenti, Oligo dT ma jistax jintuża waħdu, minħabba li l-użu ta 'Oligo dT waħdu jista' jikkawża 3′ ​​end bias, li jwassal għal riżultati mhux preċiżi tal-esperiment qPCR;
(4) miRNA: Jistgħu jintużaw primers Stem-loop jew primers tailing.

Kemm-il darba għandu jiġi dilwit il-prodott ta' traskrizzjoni inversa cDNA għall-kwantifikazzjoni?
Wara li tinkiseb is-cDNA tal-prodott tat-traskrizzjoni inversa, kemm-il darba s-cDNA għandu jiġi dilwit għal esperimenti qPCR huwa importanti ħafna.Jekk il-konċentrazzjoni ta 'cDNA hija għolja wisq jew baxxa wisq, l-effiċjenza ta' amplifikazzjoni tista 'tiġi affettwata.Tista' titkejjel il-konċentrazzjoni ta' cDNA, u kif għandha ssir?
(1) Il-konċentrazzjoni ta 'cDNA tal-prodott ta' traskrizzjoni inversa ma tistax titkejjel, minħabba li minbarra l-prodott ta 'traskrizzjoni inversa, il-prodott ta' traskrizzjoni inversa fih ukoll Buffer residwu ta 'traskrizzjoni inversa, reverse transcriptase, primers, eċċ., Li jinterferixxu mar-riżultati tal-kejl tal-konċentrazzjoni u jikkawżaw OD260/280, OD260/ 230 proporzjon veru anormali u għalhekk ma jirriflettix veru cDNA.F'dan iż-żmien, xi ħbieb jgħidu, allura nkejjel il-konċentrazzjoni wara l-purifikazzjoni;hawn, Foregene jixtieq ifakkar li s-cDNA mhux rakkomandat li jiġi ppurifikat, minħabba li t-tul tas-cDNA miksub bit-treġġigħ lura huwa differenti, u s-cDNA qasir jintilef fil-purifikazzjoni.
(2) Allura x'għandek tagħmel?Qabel l-esperiment qPCR, il-gradjent ta 'dilwizzjoni tas-cDNA jista' jiġi determinat permezz tal-pre-esperiment.Per eżempju: uża soluzzjoni stokk cDNA, dilwizzjoni ta '10 darbiet, u dilwizzjoni ta' 100 darbiet bħala mudelli għal esperimenti qPCR, u agħżel il-fattur ta 'dilwizzjoni b'valur CT fil-medda ta' 18-28.

Kif għandhom il-miRNAs jiġu traskritti b'lura?
miRNA huwa RNA ta 'molekula żgħira b'linja waħda b'daqs ta' madwar 22 nt li ma jikkodifikax għall-proteina.Minħabba t-tul qasir tiegħu, il-metodu qPCR konvenzjonali huwa diffiċli biex jiġi kwantifikat direttament, għalhekk ħafna drabi huwa meħtieġ li jiġi estiż il-miRNA;il-metodi ta' traskrizzjoni inversa użati b'mod komuni għall-miRNA jinkludu l-metodu tal-loop ta' zokk u l-metodu tat-tailing.
Il-metodu stem-loop huwa li jestendi l-miRNA billi żżid primers stem-loop.Dan il-metodu ta 'skoperta għandu sensittività u speċifiċità ogħla, iżda l-fluss ta' skoperta huwa baxx.Traskrizzjoni inversa waħda tista' tiskopri biss miRNA wieħed u referenza interna;il-metodu taż-żieda tad-denb huwa magħmul minn żewġ Huwa kkompletat bl-azzjoni konġunta ta 'żewġ enzimi, li huma PolyA polymerase u reverse transcriptase.PolyA polymerase huwa responsabbli biex iżżid dnub PolyA mal-miRNA biex iżid it-tul tiegħu, u reverse transcriptase twettaq reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa.Dan il-metodu għandu throughput għoli ta 'skoperta u jista' jikxef miRNAs multipli u referenzi interni f'traskrizzjoni inversa waħda, iżda s-sensittività u l-ispeċifiċità huma baxxi fil-metodu stem-loop.


Ħin tal-post: Frar-17-2023