• facebook
  • linkedin
  • youtube

Bosta invenzjonijiet rivoluzzjonarji fl-istorja tat-teknoloġija ta 'sejbien f'moħħi huma teknoloġija ta' immunotikkettjar ibbażata fuq il-prinċipju ta 'rbit speċifiku antiġen-antikorp, teknoloġija PCR u teknoloġija ta' sekwenzar.Illum se nitkellmu dwar it-teknoloġija PCR.Skont l-evoluzzjoni tat-teknoloġija PCR, in-nies abitwalment jaqsmu t-teknoloġija PCR fi tliet ġenerazzjonijiet: teknoloġija PCR ordinarja, teknoloġija PCR kwantitattiva fluworexxenti f'ħin reali u teknoloġija PCR diġitali.

Cteknika komuni PCR

w1

KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)

Kary Mullis ivvinta r-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (reazzjoni tal-katina tal-polimerażi, PCR) fl-1983. Jingħad li meta kien qed isuq il-ħabiba tiegħu, f'daqqa waħda kellu flash ta 'ispirazzjoni u ħaseb dwar il-prinċipju tal-PCR (dwar il-benefiċċji tas-sewqan).Kary Mullis ingħatat il-Premju Nobel fil-Kimika fl-1993. In-New York Times ikkummentat: “Oriġinali ħafna u sinifikanti, kważi jaqsam il-bijoloġija f’eras pre-PCR u post-PCR.

Il-prinċipju tal-PCR: Taħt il-katalisi tad-DNA polimerażi, id-DNA tal-linja omm tintuża bħala l-mudell, u l-primer speċifiku jintuża bħala l-punt tat-tluq tal-estensjoni, u d-DNA tal-fergħa bint kumplimentari għad-DNA tal-mudell tal-linja omm hija kkupjata in vitro permezz ta 'denaturazzjoni, ittemprar, estensjoni u passi oħra.Hija teknoloġija ta 'amplifikazzjoni tas-sintesi tad-DNA in vitro, li tista' tamplifika b'mod rapidu u speċifiku kwalunkwe DNA fil-mira in vitro.

w2

Vantaġġi tal-PCR ordinarju
1.Metodu klassiku, standards internazzjonali u domestiċi kompluti
2.Spiża aktar baxxa tar-reaġenti tal-istrumenti
3.Il-prodotti tal-PCR jistgħu jiġu rkuprati għal esperimenti oħra tal-bijoloġija molekulari
Magna Foregene PCR rakkomandata: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Prodotti relatati: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Żvantaġġi ta 'PCR ordinarju
1.faċli biex iniġġes
2.operazzjoni ineffiċjenti
3.analiżi kwalitattiva biss
4.Sensittività moderata
5.Hemm amplifikazzjoni mhux speċifika, u meta l-faxxa mhux speċifika tkun l-istess daqs bħall-medda fil-mira, ma tistax tiġi distinta
 
CPCR ibbażat fuq l-elettroforeżi apillari
Bi tweġiba għan-nuqqasijiet tal-PCR ordinarju, xi manifatturi introduċew strumenti bbażati fuq il-prinċipju tal-elettroforeżi kapillari.Il-pass tal-elettroforeżi wara l-amplifikazzjoni tal-PCR jitlesta fil-kapillari.Is-sensittività hija ogħla, u d-differenza ta 'diversi bażijiet tista' tiġi distinta u l-amplifikazzjoni tista 'tiġi kkalkulata minn MAERKER.kontenut tal-prodott.L-iżvantaġġ huwa li l-prodott PCR għad irid jinfetaħ u jitqiegħed fl-istrument, u għad hemm riskju kbir ta 'kontaminazzjoni.

w3

CapillariEelettroforeżi

 

2. Teknoloġija PCR kwantitattiva fluworexxenti f'ħin reali (PCR Kwantitattiv f'ħin reali, qPCR)PCR kwantitattiv fluworexxenti, imsejjaħ ukoll PCR Real-Time, hija teknoloġija kwantitattiva ġdida ta 'aċidu nuklejku żviluppata minn PE (Perkin Elmer) fl-1995. L-istorja ta' żvilupp ta 'PCR kwantitattiv fluworexxenti hija storja ta' ġlied li jħawwad ir-ruħ ta 'ġganti bħal ABI, Roche u Bio-Rad.Jekk inti interessat, tista 'tiċċekkjaha.Din it-teknika bħalissa hija t-teknika tal-PCR semi-kwantitattiva l-aktar matura u użata ħafna.

Magna qPCR Rakkomandata: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Metodu taż-żebgħa fluworexxenti (SYBR Green I):SYBR Green I hija ż-żebgħa li torbot id-DNA l-aktar użata b'mod komuni għal PCR kwantitattiv, li torbot b'mod mhux speċifiku ma 'DNA doppju.Fl-istat ħieles, SYBR Green jarmi fluworexxenza dgħajfa, iżda ladarba jintrabat ma 'DNA bi stranded doppju, il-fluworexxenza tagħha tiżdied 1000 darba.Għalhekk, is-sinjal fluworexxenti totali emess minn reazzjoni huwa proporzjonali għall-ammont ta ' double-stranded DNA preżenti u se jiżdied biż-żieda ta ' prodott amplifikat.Peress li ż-żebgħa tintrabat b'mod mhux speċifiku mad-DNA ta' double-stranded, jistgħu jiġu ġġenerati riżultati pożittivi foloz.

Prodotti relatati: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Metodu tas-sonda fluworexxenti (teknoloġija Taqman): MatulAmplifikazzjoni tal-PCR, sonda fluworexxenti speċifika hija miżjuda fl-istess ħin bħal par primers.Is-sonda hija oligonukleotide lineari, bi grupp reporter fluworexxenti u grupp quencher fluworexxenti rispettivament immarkati fiż-żewġt itruf.Meta s-sonda tkun intatta, is-sinjal fluworexxenti emess mill-grupp reporter jiġi assorbit mill-grupp quencher, u l-iskoperta M'hemm l-ebda sinjal fluworexxenti;matul l-amplifikazzjoni tal-PCR (fl-istadju ta 'estensjoni), l-attività 5'-3' Dicer tal-enzima Taq se tiddiġerixxi u tiddegrada s-sonda, sabiex il-grupp fluworexxenti reporter u l-grupp fluworexxenti quencher jiġu separati, sabiex is-sistema ta 'monitoraġġ tal-fluworexxenza Is-sinjal fluworexxenti jista' jiġi riċevut, jiġifieri kull darba li katina tad-DNA tiġi amplifikata, sinjal fluworexxenti li jirrealizza s-sinjal fluworexxenti ta 'akkumulazzjoni fluworexxenti. s u l-formazzjoni ta ' prodotti PCR.Il-metodu tas-sonda Taqman huwa l-aktar metodu ta 'skoperta użat b'mod komuni fl-iskoperta klinika.

Prodotti relatati: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Vantaġġi tal-qPCR
1.Il-metodu huwa matur u t-tagħmir ta 'appoġġ u r-reaġenti huma kompluti
2.Spiża medja tar-reaġenti
3.faċli biex tużah
4.Sensittività u speċifiċità ta 'skoperta għolja
 
Żvantaġġi tal-qPCR

Il-mutazzjoni tal-ġene fil-mira twassal għal skoperta mitlufa.
Ir-riżultat tas-sejbien ta 'mudell ta' konċentrazzjoni baxxa ma jistax jiġi determinat.
Hemm żball kbir meta tuża l-kurva standard għall-iskoperta kwantitattiva.
 
3. Teknoloġija PCR diġitali (PCR diġitali, dPCR).
Il-PCR diġitali hija teknika għall-kwantifikazzjoni assoluta tal-molekuli tal-aċidu nuklejku.Meta mqabbel mal-qPCR, il-PCR diġitali jista 'jaqra direttament in-numru ta' molekuli tad-DNA/RNA, li hija l-kwantifikazzjoni assoluta tal-molekuli tal-aċidu nuklejku fil-kampjun tal-bidu.Fl-1999, Bert Vogelstein u Kenneth W. Kin-zler ipproponew formalment il-kunċett tad-dPCR.
 
Fl-2006, Fluidigm kienet l-ewwel waħda li pproduċiet strument kummerċjali dPCR ibbażat fuq ċippa.Fl-2009, Life Technologies nediet is-sistemi OpenArray u QuantStudio 12K Flex dPCR.Fl-2013, Life Technologies nediet is-sistema QuantStudio 3DdPCR, li tuża teknoloġija ta 'ċippa mikrofluwidika nanoskala ta' densità għolja biex tqassam b'mod ugwali kampjuni għal 20,000 ċellula individwali.fir-reazzjoni sew.

w5

Fl-2011, Bio-Rad nediet l-istrument QX100 dPCR ibbażat fuq il-qtar, li juża t-teknoloġija ta 'l-ilma fiż-żejt biex iqassam il-kampjun b'mod ugwali għal 20,000 qtar-ilma fiż-żejt, u juża analizzatur tal-qtar biex janalizza l-qtar.Fl-2012, RainDance nediet l-istrument RainDrop dPCR, immexxi minn gass bi pressjoni għolja, biex taqsam kull sistema ta 'reazzjoni standard f'emulsjoni ta' reazzjoni li fiha 1 miljun sa 10 miljun mikro-qtar fil-livell ta 'picoliter.

w6

S'issa, il-PCR diġitali ffurmat żewġ fazzjonijiet ewlenin, tip ta 'ċippa u tip ta' qtar.Ma jimpurtax f'liema tip ta 'PCR diġitali, il-prinċipji ewlenin tiegħu huma jillimitaw id-dilwizzjoni, PCR endpoint u distribuzzjoni Poisson.Is-sistema standard ta 'reazzjoni PCR li fiha mudelli ta' aċidu nuklejku hija maqsuma b'mod ugwali f'għexieren ta 'eluf ta' reazzjonijiet PCR, li huma mqassma għal ċipep jew microdroplets, sabiex kull reazzjoni jkun fiha kemm jista 'jkun molekula mudell, u titwettaq reazzjoni PCR ta' mudell ta 'molekula waħda.Bil-qari tal-fluworexxenza Il-preżenza jew l-assenza tas-sinjal tingħadd, u l-kwantifikazzjoni assoluta titwettaq wara l-kalibrazzjoni tad-distribuzzjoni statistika ta 'Poisson.

Dawn li ġejjin huma l-karatteristiċi ta’ diversi pjattaformi diġitali PCR li użajt:

1. Bio-Rad QX200 qtar PCR diġitali Bio-RadQX200 hija pjattaforma PCR diġitali klassika ħafna, il-proċess bażiku ta 'skoperta: 20,000 kampjun huma ġġenerati mill-ġeneratur tal-qtar Il-mikro-qtar tal-ilma fiż-żejt huma amplifikati fuq magna PCR ordinarja, u finalment is-sinjal tal-fluworexxenza ta' kull mikro-qtar jinqara minn qarrej ta 'mikro-qtar.L-operazzjoni hija aktar ikkumplikata, u r-riskju ta 'tniġġis huwa medju.

w7

Xinyi TD1 micro-droplet PCR diġitaliXinyi TD1 hija pjattaforma PCR diġitali domestika, il-proċess bażiku ta 'skoperta: iġġenera 30,000-50,000 qtar ta' ilma fiż-żejt permezz ta 'ġeneratur ta' qtar, amplifika fuq strument PCR komuni, u finalment jgħaddi Il-qarrej tal-qtar jaqra s-sinjal fluworexxenti ta 'kull qtar.Kemm il-ġenerazzjoni tal-qtar kif ukoll il-qari f'din il-pjattaforma jsiru f'ċippa apposta b'riskju baxx ta 'kontaminazzjoni.

w8

 STILLA Naica micro-droplet chip diġitali PCRSTILLA Naica hija pjattaforma PCR diġitali relattivament ġdida.Il-proċess ta 'sejbien bażiku huwa: żid is-soluzzjoni ta' reazzjoni maċ-ċippa, poġġi ċ-ċippa fis-sistema ta 'ġenerazzjoni u amplifikazzjoni tal-mikro-droplet, u tiġġenera 30,000 mikro-qtar.Ifrex fuq iċ-ċippa, u l-amplifikazzjoni tal-PCR titlesta fuq iċ-ċippa.Imbagħad iċ-ċippa amplifikata tiġi trasferita għas-sistema ta 'analiżi tal-qari tal-mikro-droplet, u s-sinjal fluworexxenti jinqara billi jittieħdu ritratti.Peress li l-proċess kollu jseħħ f'ċippa magħluqa, ir-riskju ta 'kontaminazzjoni huwa baxx.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip diġitali PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D hija pjattaforma PCR diġitali klassika oħra bbażata fuq ċippa.Il-proċess bażiku ta 'sejbien tiegħu huwa: żid is-soluzzjoni ta' reazzjoni fl-ispreader, u xerred is-soluzzjoni ta 'reazzjoni b'mod uniformi fuq iċ-ċippa b'20,000 microwell permezz tal-ispreader., poġġi ċ-ċippa fuq il-magna PCR biex tamplifika, u finalment poġġi ċ-ċippa fil-qarrej u ħu ritratt biex taqra s-sinjal fluworexxenti.L-operazzjoni hija relattivament ikkumplikata, u l-proċess kollu jitwettaq f'ċippa magħluqa, u r-riskju ta 'kontaminazzjoni huwa baxx.

w10

5. JN MEDSYS Ċarezza chip diġitali PCR

JN MEDSYS Ċarezza hija pjattaforma PCR diġitali tat-tip taċ-ċippa relattivament ġdida.Il-proċess bażiku ta 'sejbien tiegħu huwa: żid is-soluzzjoni ta' reazzjoni fl-applikatur, u xerred is-soluzzjoni ta 'reazzjoni b'mod uniformi fuq 10,000 tubu PCR imwaħħla fit-tubu PCR permezz tal-applikatur.Fuq iċ-ċippa mikroporuża, is-soluzzjoni ta 'reazzjoni tidħol fiċ-ċippa permezz ta' azzjoni kapillari, u t-tubu PCR biċ-ċippa jitqiegħed fuq il-magna PCR għall-amplifikazzjoni, u finalment iċ-ċippa titqiegħed fil-qarrej biex taqra s-sinjal fluworexxenti billi tieħu ritratt.L-operazzjoni hija aktar ikkumplikata.Ir-riskju ta' kontaminazzjoni huwa baxx.

w11

Il-parametri ta' kull pjattaforma diġitali PCR huma miġbura fil-qosor kif ġej:

w12

L-indikaturi ta 'evalwazzjoni tal-pjattaforma diġitali PCR huma: in-numru ta' unitajiet maqsuma, in-numru ta 'kanali fluworexxenti, il-kumplessità tal-operazzjoni u r-riskju ta' kontaminazzjoni.Iżda l-iktar ħaġa importanti hija l-eżattezza tas-sejbien.Mod wieħed biex jiġu evalwati pjattaformi PCR diġitali huwa li tuża pjattaformi PCR diġitali multipli biex tivverifika lil xulxin, u mod ieħor huwa li tuża sustanzi standard b'valuri preċiżi.

Vantaġġi tad-dPCR
1.Il-kisba ta' kwantifikazzjoni assoluta
2.Sensittività u speċifiċità ogħla
3.Jista 'jiskopri kampjuni ta' kopji baxxi
Żvantaġġi tad-dPCR1. Tagħmir u reaġenti għaljin 2. Operazzjoni ikkumplikata u ħin twil ta' skoperta 3. Firxa dejqa ta' skoperta

Fil-preżent, it-tliet ġenerazzjonijiet tat-teknoloġija PCR għandhom il-vantaġġi u l-iżvantaġġi tagħhom stess, u kull wieħed għandu l-oqsma ta 'applikazzjoni tiegħu stess, u mhix relazzjoni li ġenerazzjoni waħda tissostitwixxi lill-oħra.L-avvanz kontinwu tat-teknoloġija injetta vitalità ġdida fit-teknoloġija tal-PCR, li ppermettilha tiftaħ direzzjoni ta 'applikazzjoni waħda wara l-oħra, u b'hekk is-sejbien tal-aċidu nuklejku jsir aktar konvenjenti u preċiż.
Sors: Dr Yuan tieħdok għall-ittestjar
 
Prodotti Rakkomandati:


Ħin tal-post: Nov-18-2022