Il-PCR hija t-teknoloġija tal-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku l-aktar użata u tintuża ħafna minħabba s-sensittività u l-ispeċifiċità tagħha.Madankollu, il-PCR teħtieġ denaturazzjoni termali ripetuta u ma tistax teħles mil-limitazzjonijiet li tiddependi fuq strumenti u tagħmir, li jillimita l-applikazzjoni tiegħu fl-ittestjar tal-kamp kliniku.

Sa mill-bidu tas-snin 90, ħafna laboratorji bdew jiżviluppaw teknoloġija ta 'amplifikazzjoni ta' temperatura kostanti li ma teħtieġx denaturazzjoni termali.Issa żviluppaw teknoloġija ta 'amplifikazzjoni iżotermali medjata minn loop, teknoloġija ta' amplifikazzjoni iżotermika ta 'sostituzzjoni tal-linja, teknoloġija ta' amplifikazzjoni iżotermika ta 'ċirku rolling, u dipendenza tas-sekwenza tal-aċidu nuklejku.Teknoloġija ta 'amplifikazzjoni iżotermika u teknoloġiji oħra. 

Lamplifikazzjoni iżotermika medjata minn oop

Il-prinċipju ta 'amplifikazzjoni huwa bbażat fuq il-fatt li d-DNA huwa fi stat ta' ekwilibriju dinamiku f'madwar 65 ° C.Meta kwalunkwe primer ikun bażi-pari u estiż għall-parti kumplimentari tad-DNA double-stranded, il-linja l-oħra tiddissoċja u ssir single-stranded.

F'din it-temperatura, id-DNA juża 4 primers speċifiċi biex jiddependu fuq polimerażi tad-DNA ta 'spostament tal-fergħat biex is-sintesi tad-DNA tal-ispostament tal-fergħat tiċċirkola waħedha kontinwament.

L-ewwel iddetermina s-6 reġjuni speċifiċi F3, F2, F1, B1, B2, B3 fuq il-ġene fil-mira, u mbagħad iddisinja 4 primers ibbażati fuq dawn is-6 reġjuni speċifiċi (kif muri fil-figura hawn taħt):

Il-primer ta 'ġewwa ta' quddiem (FIP) huwa magħmul minn F1c u F2.

Il-primer ta 'ġewwa b'lura (BIP) huwa magħmul minn B1c u B2, u TTTT jintuża bħala spacer fin-nofs.

Il-primers ta' barra F3 u B3 huma rispettivament komposti minn reġjuni F3 u B3 fuq il-ġene fil-mira.

Fis-sistema ta 'reazzjoni LAMP, il-konċentrazzjoni tal-primer ta' ġewwa hija bosta drabi dik tal-primer ta 'barra.Il-primer ta 'ġewwa huwa l-ewwel ikkombinat mal-linja mudell biex tisintetizza linja komplementari biex tifforma linja doppja tad-DNA.Sussegwentement, il-primer ta 'barra huwa kkombinat mal-linja mudell biex tifforma linja doppja tad-DNA.Taħt l-azzjoni ta 'BstDNA polymerase, il-linja komplementari sintetizzata mill-primer ta' ġewwa hija rilaxxata.Wara serje ta 'reazzjonijiet, il-linja komplementari finalment tifforma linja tad-DNA waħda bi struttura dumbbell.

Il-linja waħda tad-DNA tal-istruttura tad-dumbbell innifsu tintuża bħala mudell biex tifforma kontinwament DNA tranżizzjonali ta 'struttura ta' zokk-loop b'tarf miftuħ.Il-primers ta 'ġewwa u ta' barra jiggwidaw lid-DNA ta 'struttura ta' zokk-loop transizzjonali biex kontinwament jgħaddi minn reazzjonijiet ta 'spostament u estensjoni ta' strand, u finalment jiffurmaw strutturi multipli ta 'staminali b'tulijiet differenti.Taħlita tad-DNA.

Vantaġġi u żvantaġġi ta 'amplifikazzjoni iżotermika medjata minn loop

Vantaġġi tal-LAMPA:

(1) Effiċjenza għolja ta 'amplifikazzjoni, li tista' tamplifika b'mod effettiv 1-10 kopji tal-ġene fil-mira fi żmien 1h, u l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni hija 10-100 darba dik ta' PCR ordinarja.

(2) Il-ħin ta 'reazzjoni huwa qasir, l-ispeċifiċità hija qawwija, u l-ebda tagħmir speċjali mhu meħtieġ.

Nuqqasijiet ta' LAMP:

(1) Ir-rekwiżiti għall-primers huma partikolarment għoljin.

(2) Il-prodott amplifikat ma jistax jintuża għall-klonazzjoni u s-sekwenzjar, iżda jista 'jintuża biss għal ġudizzju.

(3) Minħabba s-sensittività qawwija tiegħu, huwa faċli li tifforma aerosols, li jikkawżaw pożittivi foloz u jaffettwaw ir-riżultati tat-test.

Samplifikazzjoni tal-ispostament tat-trand

Strand displacement amplification (SDA) hija teknika ta 'amplifikazzjoni tad-DNA iżotermika in vitro bbażata fuq reazzjoni enżimatika proposta għall-ewwel darba mill-istudjuż Amerikan Walker fl-1992.

Is-sistema bażika ta 'SDA tinkludi endonuclease ta' restrizzjoni, polimerażi tad-DNA b'attività ta 'spostament tal-linji, żewġ pari ta' primers, dNTPs, u joni tal-kalċju u manjesju u sistemi buffer.

Il-prinċipju tal-amplifikazzjoni tal-ispostament tal-linja huwa bbażat fuq is-sekwenza ta 'rikonoxximent tal-endonukleażi ta' restrizzjoni modifikata kimikament fiż-żewġt itruf tad-DNA fil-mira.L-endonukleażi tiftaħ il-vojt fil-linja tad-DNA fis-sit ta 'rikonoxximent tagħha, u d-DNA polymerase testendi l-vojt 3′ Tmiem u tissostitwixxi l-linja tad-DNA li jmiss.

Il-fergħat singolu sostitwiti tad-DNA jistgħu jiġu kkombinati ma 'primers u estiżi fi linji doppji permezz tad-DNA polymerase.Dan il-proċess jiġi ripetut kontinwament, sabiex is-sekwenza fil-mira tiġi amplifikata b'mod effiċjenti.

Vantaġġi u żvantaġġi tat-teknoloġija tal-amplifikazzjoni tal-ispostament tal-linja

Vantaġġi ta 'SDA:

L-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni hija għolja, il-ħin ta' reazzjoni huwa qasir, l-ispeċifiċità hija b'saħħitha, u l-ebda tagħmir speċjali mhu meħtieġ.

Nuqqasijiet tal-SDA:

Il-prodotti mhumiex uniformi, u xi prodotti single-stranded u double-stranded huma dejjem prodotti fiċ-ċiklu SDA, u t-tailing inevitabbilment iseħħ meta jinstab mill-elettroforeżi.

Ramplifikazzjoni ċirku olling

L-amplifikazzjoni taċ-ċirku rolling (RCA) hija proposta billi jsir użu mill-metodu tal-ikkuppjar tad-DNA minn organiżmi patoġeniċi permezz ta 'ċirku rolling.Jirreferi għall-użu ta 'DNA ċirkolari single-stranded bħala mudell f'temperatura kostanti, u polimerażi tad-DNA speċjali (bħal Phi29) ) Taħt l-azzjoni tas-sinteżi tad-DNA taċ-ċirku rolling biex tinkiseb l-amplifikazzjoni tal-ġene fil-mira.

RCA jista 'jinqasam f'amplifikazzjoni lineari u amplifikazzjoni esponenzjali.L-effiċjenza ta 'RCA lineari tista' tilħaq 10⁵darbiet, u l-effiċjenza ta 'RCA esponenzjali tista' tilħaq 10⁹drabi.

Distinzjoni sempliċi, kif muri fil-figura hawn taħt, amplifikazzjoni lineari a tuża biss primer 1, amplifikazzjoni esponenzjali b għandha 2 primers.

RCA lineari jissejjaħ ukoll RCA primer wieħed.Primer jeħel ma' DNA ċirkolari u jiġi estiż bl-azzjoni tad-DNA polymerase.Il-prodott huwa linja waħda lineari b'numru kbir ta 'sekwenzi ripetittivi eluf ta' darbiet it-tul ta 'linja waħda.

Peress li l-prodott ta 'RCA lineari huwa dejjem konness mal-primer tal-bidu, l-iffissar faċli tas-sinjal huwa vantaġġ kbir.

RCA esponenzjali, magħrufa wkoll bħala Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), f'RCA esponenzjali, primer wieħed jamplifika l-prodott RCA, it-tieni primer hybridizes mal-prodott RCA u jestendi, u s-sostituzzjoni hija diġà marbuta mal-prodott RCA Il-primers downstream jestendu l-linja, u jirrepetu l-estensjoni u s-sostituzzjoni tal-prodott RCA ta 'dendritic.

Il-vantaġġi u l-iżvantaġġi tal-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku taċ-ċirku rolling

Vantaġġi ta 'RCA:

Sensittività għolja, speċifiċità tajba u tħaddim faċli.

Nuqqasijiet tar-RCA:

Problemi fl-isfond waqt l-iskoperta tas-sinjal.Matul ir-reazzjoni RCA, is-sonda tal-katnazz mhux ċirkolata u l-mudell DNA jew RNA tas-sonda mhux marbuta jistgħu jiġġeneraw xi sinjali fl-isfond. 

Namplifikazzjoni bbażata fuq is-sekwenza ucleicacid

L-amplifikazzjoni bbażata fuq is-sekwenza tal-aċidu nukleiku (NASBA) hija teknoloġija ġdida żviluppata fuq il-bażi tal-PCR.Hija amplifikazzjoni ta 'aċidu nuklejku kontinwu u iżotermali iggwidata minn par ta' primers b'sekwenza promotur T7.It-teknoloġija tista 'tamplifika l-RNA template b'madwar 109 darba f'madwar sagħtejn, li hija 1000 darba ogħla mill-metodu PCR konvenzjonali u ma teħtieġx tagħmir speċjali.

Din it-teknoloġija ntużat għal dijanjosi mgħaġġla tal-mard hekk kif deher, u ħafna kumpaniji bħalissa jużaw dan il-metodu f'kits ta 'skoperta tal-RNA.

Għalkemm l-amplifikazzjoni tal-RNA tista 'tuża wkoll it-teknoloġija PCR ta' traskrizzjoni inversa, NASBA għandha l-vantaġġi tagħha stess: tista 'titwettaq f'kundizzjonijiet ta' temperatura relattivament kostanti, u hija aktar stabbli u preċiża mit-teknoloġija PCR tradizzjonali.

Ir-reazzjoni hija f'41 grad Celsius u teħtieġ AMV (virus tal-majeloblastożi tat-tjur) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase u par primers biex titlesta.

Il-proċess jinkludi prinċipalment:

Il-primer quddiem fih is-sekwenza komplementari tal-promotur T7.Matul ir-reazzjoni, il-primer 'l quddiem jeħel mal-fergħa RNA u jiġi katalizzat mill-enzima AMV biex tifforma linja doppja ta' DNA-RNA.

RNase H jiddiġerixxi l-RNA fl-ibridu double-strand u jżomm id-DNA single-stranded.

Taħt l-azzjoni tal-primer invers u l-enzima AMV, tiġi ffurmata linja doppja tad-DNA li fiha s-sekwenza tal-promotur T7.

Taħt l-azzjoni ta 'T7 RNA polymerase, il-proċess ta' traskrizzjoni jitlesta u jiġi prodott ammont kbir ta 'RNA fil-mira.

Vantaġġi ta 'NASBA:

(1) Il-primer tiegħu għandu sekwenza ta 'promotur T7, iżda d-DNA barrani bi strand doppju m'għandu l-ebda sekwenza ta' promotur T7 u ma jistax jiġi amplifikat, għalhekk din it-teknoloġija għandha speċifiċità u sensittività għolja.

(2) NASBA jinkorpora direttament il-proċess ta 'traskrizzjoni inversa fir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni, u jqassar il-ħin ta 'reazzjoni.

Żvantaġġi ta 'NASBA:

(1) Il-komponenti tar-reazzjoni huma aktar ikkumplikati.

(2) Tliet tipi ta 'enzimi huma meħtieġa biex jagħmlu l-ispiża tar-reazzjoni ogħla.