Il-valur Ct huwa l-aktar forma importanti ta 'preżentazzjoni tar-riżultat ta' PCR kwantitattiv fluworexxenti.Jintuża biex jikkalkula d-differenzi fl-espressjoni tal-ġeni jew in-numru tal-kopja tal-ġeni.Allura x'inhu l-valur Ct tal-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza meqjusa raġonevoli?Kif tiżgura l-firxa effettiva tal-valur Ct?
X'inhu Valur Ct?
Matul il-proċess ta 'amplifikazzjoni qPCR, in-numru korrispondenti ta' ċikli ta 'amplifikazzjoni (Limita taċ-Ċiklu) meta s-sinjal ta' fluworexxenza tal-prodott amplifikat jilħaq il-limitu ta 'fluworexxenza stabbilit.C tfisser Cycle u T tirreferi għal Threshold.Fi kliem sempliċi, il-valur Ct huwa n-numru ta 'ċikli li jikkorrispondu għal meta l-amplifikazzjoni inizjali tal-mudell tilħaq ċertu ammont ta' prodott f'qPCR.L-hekk imsejjaħ "ċertu ammont ta 'prodott" se jiġi spjegat aktar 'il quddiem.
X'jagħmel il-valur Ct?
1. Relazzjoni bejn l-amplifikazzjoni esponenzjali, l-ammont tal-mudell u l-valur Ct
Idealment, il-ġeni fil-qPCR huma akkumulati permezz ta 'amplifikazzjoni esponenzjali wara ċertu numru ta' ċikli.Ir-relazzjoni bejn in-numru ta' ċikli ta' amplifikazzjoni u l-ammont ta' prodotti hija: Ammont tal-prodott amplifikat = ammont inizjali tal-mudell × (1+En) numru ta' ċikli.Madankollu, ir-reazzjoni qPCR mhix dejjem f'sitwazzjoni ideali.Meta l-ammont ta 'prodott amplifikat jilħaq "ċertu ammont ta' prodott", in-numru ta 'ċikli f'dan il-ħin huwa l-valur Ct, u huwa fil-perjodu ta' amplifikazzjoni esponenzjali.Ir-relazzjoni bejn il-valur Ct u l-ammont tal-mudell tal-bidu: Hemm relazzjoni lineari bejn il-valur Ct tal-mudell u l-logaritmu tan-numru tal-kopja tal-bidu tal-mudell.Aktar ma tkun għolja l-konċentrazzjoni inizjali tal-mudell, iżgħar ikun il-valur Ct;iktar ma tkun baxxa l-konċentrazzjoni inizjali tal-mudell, iktar ikun kbir il-valur Ct.
2.Kurva ta 'amplifikazzjoni, limitu tal-fluworexxenza u ċertu ammont ta' prodott PCR
L-ammont ta 'prodott ta' amplifikazzjoni qPCR huwa ppreżentat direttament fil-forma ta 'sinjal fluworexxenti, jiġifieri, il-kurva ta' amplifikazzjoni.Fl-istadju bikri tal-PCR, l-amplifikazzjoni hija taħt kundizzjonijiet ideali, in-numru ta 'ċikli huwa żgħir, l-akkumulazzjoni tal-prodott hija żgħira, u l-livell ta' fluworexxenza ma jistax jiġi distint b'mod ċar mill-isfond tal-fluworexxenza.Wara dan, il-fluworexxenza tiżdied u tidħol fil-fażi esponenzjali.L-ammont ta 'prodott PCR jista' jiġi skopert f'ċertu punt meta r-reazzjoni tal-PCR tkun biss fil-fażi esponenzjali, li tista 'tintuża bħala "ċertu ammont ta' prodott", u l-kontenut inizjali tal-mudell jista 'jiġi dedott minn dan.Għalhekk, l-intensità tas-sinjal tal-fluworexxenza li tikkorrispondi għal ċertu ammont ta 'prodott hija l-limitu tal-fluworexxenza.
Fl-istadju tard tal-PCR, il-kurva ta 'amplifikazzjoni m'għadhiex turi amplifikazzjoni esponenzjali, u tidħol fil-fażi lineari u l-fażi tal-plateau.
3.Riproduċibbiltà tal-valuri Ct
Meta ċ-ċiklu tal-PCR jilħaq in-numru taċ-ċiklu tal-valur Ct, għadu kemm daħal fil-perjodu ta 'amplifikazzjoni esponenzjali vera.F'dan iż-żmien, l-iżball żgħir ma ġiex amplifikat, għalhekk ir-riproduċibbiltà tal-valur Ct hija eċċellenti, jiġifieri, l-istess mudell huwa amplifikat f'ħinijiet differenti jew f'tubi differenti fl-istess ħin.Amplifikazzjoni, il-valur Ct miksub huwa kostanti.
1.Effiċjenza ta 'amplifikazzjoni En
L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR tirreferi għall-effiċjenza li biha l-polimerażi tikkonverti l-ġene li għandu jiġi amplifikat f'amplicon.L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni meta molekula waħda tad-DNA tiġi trasformata f'żewġ molekuli tad-DNA hija 100%.L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija komunement espressa bħala En.Sabiex tiġi ffaċilitata l-analiżi tal-artikoli sussegwenti, il-fatturi li jaffettwaw l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni huma introdotti fil-qosor.
| Fatturi li jinfluwenzaw | spjegazzjoni | Kif tiġġudika? |
| A. Inibituri tal-PCR | 1. Il-mudell tad-DNA fih sustanzi li jinibixxu r-reazzjoni tal-PCR, bħal proteini jew deterġenti.2. Is-cDNA wara t-traskrizzjoni inversa fih konċentrazzjoni għolja ta 'mudell RNA jew komponenti ta' reaġent RT, li jistgħu wkoll jinibixxu r-reazzjoni sussegwenti tal-PCR. | 1. Jekk hemmx tniġġis jista 'jiġi ġġudikat billi jitkejjel il-proporzjon ta' A260/A280 u A260/A230 jew elettroforesi RNA.2. Jekk is-cDNA huwiex dilwit skont ċertu proporzjon wara t-traskrizzjoni inversa. |
| B. Disinn mhux xieraq tal-primer | Primers ma jannealx b'mod effiċjenti | Iċċekkja primers għal primer-dimers jew hairpins, diskrepanzi, u xi drabi jkopru disinji intrronici. |
| C. Disinn mhux xieraq tal-programm ta 'reazzjoni tal-PCR | 1. Primers ma jistgħux ittemprar b'mod effettiv2. Rilaxx insuffiċjenti tad-DNA polymerase 3. L-attività tal-polimerażi tad-DNA ta 'temperatura għolja fit-tul naqset | 1. It-temperatura ta 'l-ittemprar hija ogħla mill-valur TM tal-primer2. Il-ħin ta 'qabel id-denaturazzjoni huwa qasir wisq 3. Il-ħin ta 'kull stadju tal-proċedura ta' reazzjoni huwa twil wisq |
| D. Taħlit insuffiċjenti ta' reaġenti jew żbalji fil-pipetta | Fis-sistema ta 'reazzjoni, il-konċentrazzjoni lokali tal-komponenti tar-reazzjoni tal-PCR hija għolja wisq jew irregolari, li tirriżulta f'amplifikazzjoni mhux esponenzjali tal-amplifikazzjoni tal-PCR | |
| E. Tul ta 'Amplicon | It-tul tal-amplicon huwa twil wisq, jaqbeż it-300bp, u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija baxxa | Iċċekkja li t-tul tal-amplicon ikun bejn 80-300bp |
| F. Influwenza tar-reaġenti qPCR | Il-konċentrazzjoni tad-DNA polymerase fir-reaġent hija baxxa jew il-konċentrazzjoni tal-joni fil-buffer mhix ottimizzata, u dan jirriżulta fl-attività tal-enzima Taq ma tilħaqx il-massimu | Determinazzjoni tal-effiċjenza tal-amplifikazzjoni bil-kurva standard |
2.Firxa ta 'valuri Ct
Il-valuri Ct ivarjaw minn 15-35.Jekk il-valur Ct huwa inqas minn 15, jitqies li l-amplifikazzjoni hija fil-medda tal-perjodu tal-linja bażi u l-limitu tal-fluworexxenza ma jkunx intlaħaq.Idealment, hemm relazzjoni lineari bejn il-valur Ct u l-logaritmu tan-numru inizjali tal-kopja tal-mudell, jiġifieri, il-kurva standard.Permezz tal-kurva standard, meta l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija 100%, il-valur Ct ikkalkulat għall-kwantifikazzjoni tan-numru ta 'kopja waħda tal-ġene huwa ta' madwar 35. Jekk ikun akbar minn 35, in-numru inizjali tal-kopja tal-mudell huwa teoretikament inqas minn 1, li jista 'jitqies bla sens.
Għal firxiet Ct tal-ġeni differenti, minħabba d-differenza fin-numru tal-kopja tal-ġene u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni fl-ammont inizjali tal-mudell, huwa meħtieġ li ssir kurva standard għall-ġene u tikkalkula l-firxa ta 'skoperta lineari tal-ġene.
3.Fatturi li jinfluwenzaw il-valur Ct
Mir-relazzjoni bejn in-numru ta 'ċikli ta' amplifikazzjoni u l-ammont ta 'prodott: ammont ta' prodott amplifikat = ammont ta 'mudell inizjali × (1+En) numru taċ-ċiklu, wieħed jista' jara li taħt kundizzjonijiet ideali, l-ammont ta 'mudell inizjali u En se jkollhom impatt negattiv fuq il-valur Ct huwa affettwat.Id-differenza fil-kwalità tal-mudell jew l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tikkawża li l-valur Ct ikun kbir wisq jew żgħir wisq.
Il-valur 4.Ct huwa kbir wisq jew żgħir wisq
Ħin tal-post: Frar-22-2023
