1. Skopri l-assorbiment tas-soluzzjoni RNA
Assorbanza f'280, 320, 230, u 260 nm tirrappreżenta l-valuri ta 'aċidu nuklejku, sfond (turbidità tas-soluzzjoni), konċentrazzjoni tal-melħ, u materja organika bħal proteina, rispettivament.Ġeneralment tħares biss lejn OD260/OD280 (Proporzjon, R).Meta 1.8 ~ 2.0, naħsbu li l-kontaminazzjoni ta 'proteina jew materja organika oħra fl-RNA tista' tiġi tollerata, iżda għandu jiġi nnutat li meta Tris jintuża bħala l-buffer biex jikxef l-assorbiment, il-valur R jista 'jkun akbar minn 2 (ġeneralment għandu jkun <2.2).Meta R<1.8, it-tniġġis tal-proteina jew materja organika oħra fis-soluzzjoni huwa aktar ovvju, u d-destin tal-RNA jista 'jiġi determinat skont il-ħtiġijiet.Meta R>2.2, dan ifisser li l-RNA ġie idrolizzat f'aċidu nuklejku wieħed.
Mudell 2.Electrophoretic ta 'RNA
Ġeneralment, il-ġel tad-diżnaturazzjoni jintuża għall-elettroforesi tal-RNA, iżda jekk huwa biss għall-iskoperta tal-kwalità tal-RNA, il-ġel tad-diżnaturazzjoni mhuwiex meħtieġ, u jista 'jintuża ġel tal-agarose ordinarju.L-iskop tal-elettroforeżi huwa li tiskopri l-integrità tal-meded 28S u 18S u l-proporzjon tagħhom, jew l-integrità tal-mRNA smear.Ġeneralment, jekk il-meded 28S u 18S huma jleqqu, ċari u li jaqtgħu (b'referenza għat-truf tal-meded huma ċari), u l-luminożità ta '28S hija aktar mid-doppju ta' dik tal-medda 18S, aħna nqisu l-kwalità tal-RNA bħala tajba.
Dawn ta 'hawn fuq huma ż-żewġ metodi li nużaw b'mod komuni, iżda l-ebda wieħed minn dawn iż-żewġ metodi ma jista' jgħidilna b'mod ċar jekk hemmx RNase residwu fis-soluzzjoni tal-RNA.Jekk hemm ammont żgħir ħafna ta 'RNase fis-soluzzjoni, huwa diffiċli għalina li niskopruh bil-metodu ta' hawn fuq, iżda ħafna mir-reazzjonijiet enżimatiċi sussegwenti jitwettqu f'aktar minn 37 grad u għal żmien twil.B'dan il-mod, jekk ikun hemm ammont żgħir ħafna ta 'RNase fis-soluzzjoni RNA, allura jkun hemm ambjent u ħin adattat ħafna biex jaqdu r-rwol tagħhom fl-esperimenti sussegwenti, u naturalment l-esperiment ikun kiesaħ f'dan il-ħin.Hawn taħt nintroduċu metodu li jista 'jikkonferma jekk hemmx RNase residwu fis-soluzzjoni tal-RNA.
3. Test tal-preservazzjoni tas-sħana
Skont il-konċentrazzjoni tal-kampjun, iġbed żewġ 1000 ng RNA mis-soluzzjoni RNA u żidha ma 'tubu ċentrifugu ta' 0.5 ml, u jissupplimentaha b'pH 7.0 Tris buffer għal volum totali ta '10 ul, u mbagħad issiġilla l-għatu tat-tubu.Poġġi waħda minnhom f'banju ta 'l-ilma b'temperatura kostanti f'70 ° C u żommha sħuna għal siegħa.Il-parti l-oħra nħażnet fi friġġ -20°C għal siegħa.Meta l-ħin ikun għadda, neħħi ż-żewġ kampjuni għall-elettroforeżi.Wara li titlesta l-elettroforeżi, qabbel il-meded elettroforetiċi tat-tnejn.Jekk il-meded tat-tnejn huma konsistenti jew m'għandhom l-ebda differenza sinifikanti (naturalment, il-meded tagħhom jissodisfaw ukoll il-kundizzjonijiet fil-metodu 2), dan ifisser li m'hemm l-ebda kontaminazzjoni residwa RNase fis-soluzzjoni RNA, u l-kwalità tal-RNA hija tajba ħafna.Għall-kuntrarju, jekk il-kampjun inkubat f'70 ° C juri degradazzjoni ovvja, jindika li hemm kontaminazzjoni RNase fis-soluzzjoni RNA.
2 Metodi u tekniki sperimentali għall-estrazzjoni tal-RNA
Il-problemi li spiss niltaqgħu magħhom meta niġbdu l-RNA huma: (1) ir-rendiment tal-RNA huwa baxx;(2) L-RNA għandu tniġġis serju tal-melħ;(3) RNA għandu tniġġis serju b'solvent organiku;(4) degradazzjoni tal-kampjun u problemi oħra
1. Reaġenti ta 'estrazzjoni ta' RNA totali użati b'mod komuni
Il-metodu guanidine isothiocyanate u l-metodu Trizol huma l-aktar metodi komunement użati għall-estrazzjoni ta 'RNA totali minn tessuti ta' l-annimali u ċelloli ta 'l-annimali.Huwa speċjalment adattat għal kampjuni żgħar u tessuti li huma partikolarment diffiċli biex jiġu estratti, bħall-estrazzjoni ta 'RNA totali minn ġilda tal-fenek u tessut konnettiv tal-annimali;barra minn hekk, Trizol, bħala reaġent liżi għal skopijiet ġenerali, jista 'jintuża wkoll għall-estrazzjoni ta' tessuti tal-pjanti, batterji, fungi u tessuti oħra.Għal tessuti tal-pjanti li fihom polysaccharides u polyphenols, bħal camellia oleifera, weraq tat-te, żerriegħa tal-kolza, eċċ., Il-metodu CTAB jista 'jintuża wkoll biex jiġi estratt RNA totali.
Bħala metodu konvenzjonali, il-metodu ta 'kolonna doppja huwa wkoll popolari ħafna minħabba l-operat tat-temperatura normali tiegħu, l-ebda ħtieġa li żżid RNase, u s-sigurtà — l-ebda kloroform, fenoli u reaġenti organiċi oħra għall-estrazzjoni.(prodotti rakkomandati )
2. Estrazzjoni ta 'RNA totali minn tessuti ta' l-annimali
(1) Ipprova agħżel tessut frisk, jekk ma jkunx frisk (preferibbilment fi żmien tliet xhur - 80 ℃ friġġ jew iffriżat fin-nitroġenu likwidu. Meta taqta 'tessut, ma taqtax direttament f'temperatura tal-kamra, kun żgur li Poġġiha fuq il-kaxxa tas-silġ, ipprova tevita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti.
(2) Uża imqass u pinzetti nodfa biex taqta 'biċċa żgħira ta' tessut, ipprova taqta 'l-parti ċentrali tat-tessut meta taqta' l-kampjun, jew l-ewwel aqta 'l-biċċa kbira ta' tessut min-nofs, u mbagħad aqta 'l-kampjun fil-pożizzjoni ta' inċiżjoni friska.It-tessut imneħħi għandu jkun imqatta 'kompletament, poġġi t-tessut imqatta' f'tubu EP mingħajr RNase, żid il-lysate, it-tessut imqatta għandu jkun espost għal kollox għal-lysate, u pprepara għall-omoġenizzazzjoni.
(3) Għal tessuti normali, agħżel tessuti ta 'daqs ta' fażola mung (30-60 mg) għall-omoġenizzazzjoni.Jekk it-tessuti jkun fihom ammont kbir ta 'proteina, xaħam, jew tessuti fibrużi densi bħall-fwied, żid jew tnaqqas b'mod xieraq l-ammont ta' tessuti maqtugħin (mhux obbligatorju) Agħżel 10 ~ 20 mg).
(4) Jekk il-muskoli tal-ħut, il-laħam tal-gambli, il-bram u tessuti oħra b'kontenut għoli ta 'ilma jiġu estratti, il-volum tal-kampjun għandu jiżdied b'mod xieraq (rakkomandat 100-200 mg).
(5) Jekk il-kundizzjonijiet jippermettu, it-tessut tal-annimali jista 'jiġi estratt direttament wara li jiġi omoġenizzat b'omoġenizzatur tat-tessuti ta' passaġġ għoli, jekk ma jkunx hemm tali tagħmir.
(6) L-RNA miksub wara l-estrazzjoni finali għandu jitqiegħed fuq il-kaxxa tas-silġ immedjatament biex titnaqqas id-degradazzjoni tal-RNA.
3. Estrazzjoni ta 'RNA taċ-ċelluli ta' l-annimali
(1) Ċelloli ta 'sospensjoni: ċentrifuga direttament u armi l-medju, aħsel b'PBS sterili għal 1-2 darbiet, imbagħad issospendi b'ammont xieraq ta' PBS, u mbagħad żid lysate għal liżi.Żidx il-lisat direttament maċ-ċelloli preċipitati wara li tarmi kompletament il-likwidu.Dan jikkawża li l-pakkett tal-histone rilaxxat wara li ċ-ċelloli lisati fuq is-saff ta 'barra jaderixxu ma' barra taċ-ċelloli preċipitati, u b'hekk jillimita l-kuntatt taċ-ċelloli ġewwa l-pellet mal-lisat., li jirriżulta f'liżi taċ-ċelluli mhux kompluta u rendiment imnaqqas ta 'RNA.
(2) Ċelloli li huma semi-aderenti jew li ma jaderixxux sewwa: Wara li tarmi l-medium, aħsel b'PBS għal 1-2 darbiet, imbagħad jassorbi direttament ammont xieraq ta 'PBS u nfaħ id-dixx tal-kultura b'pipetta jew pistola biex jonfoħ iċ-ċelloli, u ttrasferihom għal ċelloli ħielsa mill-RNA.Żid il-lisat mat-tubu EP tal-enzima għall-estrazzjoni.
(3) Ċelloli aderenti: jeħtieġ li jiġu diġeriti bi trypsin l-ewwel, imbagħad miġbura f'tubi EP ħielsa minn RNase, ċentrifugati biex tneħħi s-supernatant, maħsula 1-2 darbiet b'PBS biex tneħħi trypsin żejjed, u sospiżi mill-ġdid b'ammont xieraq ta 'PBS Imbagħad ipproċedi għall-pass ta' estrazzjoni.
4. Estrazzjoni tal-RNA tal-pjanti
It-tessuti tal-pjanti huma sinjuri f'komposti fenoliċi, jew sinjuri f'polisakkaridi, jew fihom xi metaboliti sekondarji mhux identifikati, jew għandhom attività għolja ta 'RNase.Dawn is-sustanzi huma kkombinati sewwa ma 'RNA wara liżi taċ-ċelluli biex jiffurmaw kumplessi li ma jinħallux jew preċipitati kollojdali, li huma diffiċli biex jitneħħew.Għalhekk, meta niġbdu t-tessut tal-pjanti, għandna bżonn nagħżlu kit għall-pjanti.Il-lisat fil-kit jista 'jsolvi b'mod effettiv il-problemi ta' ossidazzjoni faċli ta 'polifenoli u separazzjoni ta' komposti ta 'polisakkaridi u aċidi nuklejċi.
(Għall-estrazzjoni tal-RNA tal-pjanti tal-polysaccharide polyphenol, prodotti rakkomandati:
(1) Il-qoxra, il-polpa, iż-żerriegħa, il-weraq, eċċ. tal-pjanta għandhom ikunu mitħun għal kollox f'mehrież.Matul il-proċess tat-tħin, in-nitroġenu likwidu għandu jimtela fil-ħin biex jiġi evitat li jdub il-kampjun.Il-kampjun mitħun għandu jiġi miżjud malajr mal-lisat u jitħawwad biex tiġi evitata d-degradazzjoni tal-RNA.
(2) Għal kampjuni b'ħafna fibra bħal ross u weraq tal-qamħ, l-ammont ta 'estrazzjoni għandu jitnaqqas b'mod xieraq, inkella t-tħin u l-liżi tat-tessuti ma jkunux kompluti, li jirriżultaw f'rendiment baxx ta' RNA estratt.
(3) Għal tessuti tal-pjanti b'kontenut għoli ta 'ilma, bħal frott tar-rummien, frott tad-dulliegħa, frott tal-ħawħ, eċċ., Id-daqs tal-kampjun għandu jiżdied b'mod xieraq (100-200 mg huwa fakultattiv).
(4) It-tessuti tal-pjanti, bħal weraq tal-pjanti, riżomi, frott iebes u materjali oħra huma ġeneralment rakkomandati li jużaw nitroġenu likwidu biex imehries sewwa l-ingredjenti f'mehrież, u mbagħad ipproċedi għall-pass ta 'estrazzjoni.Omoġenizzaturi tat-tessuti konvenzjonali jistgħu ma jkunux effettivi fl-omoġenizzazzjoni tat-tessuti tal-pjanti, u ġeneralment mhumiex rakkomandati.
5. Prekawzjonijiet għall-estrazzjoni tal-RNA
(1) Il-kampjuni tat-tessuti għandhom ikunu friski kemm jista 'jkun biex jiġi evitat iffriżar u tidwib ripetut.
(2) It-tessut għandu jkun mitħun bis-sħiħ waqt l-estrazzjoni, u l-ammont ta 'tessut m'għandux ikun ftit wisq, aħseb u ara wisq.
(3) Għandu jingħata ħin biżżejjed ta 'inkubazzjoni wara li jiżdied il-lisat biex il-kampjun jiġi lisat bis-sħiħ.
(4) Meta tuża l-metodu Trizol għall-estrazzjoni, il-prinċipju li jassorbi s-supernatant wara l-istratifikazzjoni huwa "jippreferi li jieħu n-nifs inqas milli jieħu n-nifs aktar", u m'għandux estratt fis-saff tan-nofs, inkella jikkawża kontaminazzjoni serja tad-DNA ġenomika.
(5) Waqt il-ħasil, il-likwidu tal-ħasil għandu jinfiltra bis-sħiħ madwar il-ħajt tat-tubu biex jiżgura ħasil bir-reqqa.
(6) Għall-metodu ta 'estrazzjoni tal-kolonna, minbarra li tinqala' l-kolonna wara l-ħasil, il-kolonna ta 'l-adsorbiment għandha titqiegħed ukoll f'bank ultra-nadif u minfuħa għal 5-10 minuti biex is-solvent organiku jiġi evaporat għal kollox għan-nixfa.
(7) Fl-aħħar elużjoni tal-metodu tal-kolonna, wara li żżid l-ilma DEPC, għandha tiġi inkubata għal 3-5 minuti, jew l-ilma DEPC għandu jissaħħan sa 60 ° C bil-quddiem biex iżid ir-rendiment tal-elużjoni.Fil-metodu tradizzjonali tal-qsim ta 'Trizol u l-preċipitazzjoni tal-isopropanol, l-RNA finali jinħall fl-ilma DEPC, għalhekk għandu jingħata ħin xieraq għad-dissoluzzjoni, u l-qiegħ tat-tubu ċentrifugu għandu jintefaħ kontinwament b'ponta tal-pipetta.
3 Theree Kawżi u soluzzjonijiet għal konċentrazzjoni baxxa ta' RNA/kwalità fqira
1. Ir-rendiment huwa baxx wisq
Il-kampjun estratt huwa baxx wisq, l-ammont totali huwa insuffiċjenti, jew il-kampjun estratt huwa wisq u l-liżi mhix kompluta;it-tessut jew ċelluli ta 'kwalità xierqa għandhom jintużaw għall-estrazzjoni, it-trattament minn qabel tal-kampjun għandu jsir tajjeb, u l-liżi għandha tkun biżżejjed.
2. Residwi tal-ġenoma
Meta jiġi estratt bil-metodu Trizol, meta s-supernatant jiġi miġbud fis-saff tan-nofs wara l-isaffi, se tkun ikkawżata kontaminazzjoni serja tal-ġenoma;attenzjoni żejda għandha tingħata meta saffi biex jiġi evitat irdigħ fis-saff tan-nofs.Jekk jintuża l-metodu tal-kolonna għall-estrazzjoni, jista’ jintgħażel kit li jkun fih DNase I għall-estrazzjoni.L-aċidu nuklejku adsorbit fuq il-membrana huwa direttament diġerit b'DNase I, li jista 'jnaqqas ħafna r-residwi tad-DNA.
3. Degradazzjoni tal-RNA
Jista 'jkun id-degradazzjoni tal-kampjun estratt innifsu, jew id-degradazzjoni kkawżata matul il-proċess ta' estrazzjoni;kemm jista 'jkun, għandhom jintużaw kampjuni friski għall-estrazzjoni tal-RNA, u l-kampjuni miġbura għandhom jinħażnu f'nitroġenu likwidu jew friġġ -80 ° C fil-ħin, u l-iffriżar u t-tidwib ripetuti għandhom jiġu evitati.RNase/DNase ħielsa pariri, tubi ċentrifugi u materjali oħra għandhom jintużaw fil-proċess ta ' estrazzjoni RNA.Il-proċess ta 'estrazzjoni għandu jkun malajr kemm jista' jkun.L-RNA estratt għandu jitqiegħed fuq kaxxa tas-silġ u jinħażen fi -80 fil-ħin.Jekk l-RNA estratt jeħtieġ li jiġi skopert mill-elettroforeżi tal-ġel, l-elettroforeżi għandha titwettaq immedjatament wara l-estrazzjoni, u l-buffer tal-elettroforeżi għandu jiġi sostitwit b'wieħed ippreparat ġdid.
4. Melħ u residwi tas-solvent organiku
Ir-reaġenti ta 'estrazzjoni fihom melħ tal-fenol u guanidine, u s-soluzzjoni tal-ħasil fiha l-etanol.Matul il-proċess ta 'estrazzjoni, il-lisat ma kienx kompletament assorbit u mormi, u s-soluzzjoni tal-ħasil ma kinitx imnixxfa għal kollox.Melħ residwu u solventi organiċi huma ta 'ħsara għat-traskrizzjoni inversa sussegwenti u PCR.Gradi differenti ta 'inibizzjoni, għalhekk il-lisat tat-tessut għandu jitneħħa għal kollox matul il-proċess ta' estrazzjoni, u l-ħasil għandu jkun biżżejjed sabiex il-ħitan tal-madwar tat-tubu jkunu jistgħu jinħaslu.Barra minn hekk, it-tubu jitbattal u minfuħa huwa pass meħtieġ, li jkompli jnaqqas ir-residwu ta 'materja organika.
Għal aktar informazzjoni dwar l-estrazzjoni tal-RNA, jekk jogħġbok segwi l-websajt tagħna:
www.foreivd.com għal aktar informazzjoni.
Ħin tal-post: Diċ-01-2022
