It-teknoloġija ta 'dijanjosi molekulari tuża metodi ta' bijoloġija molekulari biex tiskopri l-espressjoni u l-istruttura tal-materjal ġenetiku tal-ġisem tal-bniedem u diversi patoġeni, sabiex tikseb l-iskop ta 'tbassir u dijanjosi ta' mard.

F'dawn l-aħħar snin, bl-aġġornament u l-iterazzjoni tat-teknoloġija dijanjostika molekulari, l-applikazzjoni klinika tad-dijanjostika molekulari saret aktar u aktar estensiva u fil-fond, u s-suq tad-dijanjostika molekulari daħal f'perjodu ta 'żvilupp rapidu.

L-awtur jiġbor fil-qosor it-teknoloġiji dijanjostiċi molekulari komuni fis-suq, u huwa maqsum fi tliet partijiet: l-ewwel parti tintroduċi t-teknoloġija PCR, it-tieni parti tintroduċi t-teknoloġija ta 'amplifikazzjoni iżotermali tal-aċidu nuklejku, u t-tieni parti tintroduċi t-teknoloġija tas-sekwenzjar.

01

Parti I: Teknoloġija PCR

Teknoloġija PCR

PCR (reazzjoni tal-katina tal-polimerażi) hija waħda mit-teknoloġiji in vitro ta 'amplifikazzjoni tad-DNA, bi storja ta' aktar minn 30 sena.

It-teknoloġija PCR kienet pijuniera fl-1983 minn Kary Mullis ta' Cetus, l-Istati Uniti.Mullis applika għal privattiva tal-PCR fl-1985 u ppubblika l-ewwel karta akkademika tal-PCR dwar ix-Xjenza fl-istess sena.Mullis rebaħ il-Premju Nobel fil-Kimika fl-1993.

Prinċipji Bażiċi tal-PCR

Il-PCR jista' jamplifika l-frammenti tad-DNA fil-mira b'aktar minn miljun darba.Il-prinċipju huwa li taħt il-katalisi tad-DNA polymerase, id-DNA tal-linja ġenitur tintuża bħala mudell, u primer speċifiku jintuża bħala l-punt tat-tluq għall-estensjoni.Huwa replikat in vitro permezz ta 'passi bħal denaturazzjoni, ittemprar, u estensjoni.Il-proċess tad-DNA tal-linja bint kumplimentari għad-DNA tal-mudell tal-linja ġenitur.

Il-proċess standard tal-PCR huwa maqsum fi tliet passi:

1. Denaturazzjoni: Uża temperatura għolja biex tissepara linji doppji tad-DNA.Ir-rabtiet ta 'l-idroġenu bejn il-linji doppji tad-DNA jitkissru f'temperaturi għoljin (93-98 ° C).

2. Ittremprar: Wara li d-DNA bi strand doppju jiġi sseparat, it-temperatura titbaxxa sabiex il-primer ikun jista 'jorbot mad-DNA single-stranded.

3. Estensjoni: Il-polimerażi tad-DNA tibda tisintetizza linji komplementari tul il-fergħat tad-DNA mill-primers marbuta meta t-temperatura titbaxxa.Meta titlesta l-estensjoni, jitlesta ċiklu, u n-numru ta 'frammenti tad-DNA jirdoppja.

B'reċiproka ta 'dawn it-tliet passi 25-35 darba, in-numru ta' frammenti tad-DNA se jiżdied b'mod esponenzjali.

L-għerf tal-PCR huwa li primers differenti jistgħu jiġu ddisinjati għal ġeni fil-mira differenti, sabiex il-frammenti tal-ġeni fil-mira jistgħu jiġu amplifikati f'perjodu qasir ta 'żmien.

S'issa, il-PCR jista 'jinqasam fi tliet kategoriji, jiġifieri PCR ordinarju, PCR kwantitattiv fluworexxenti u PCR diġitali.

L-ewwel ġenerazzjoni ta 'PCR ordinarju

Uża strument ordinarju ta 'amplifikazzjoni tal-PCR biex tkabbar il-ġene fil-mira, u mbagħad uża elettroforesi tal-ġel tal-agarose biex tiskopri l-prodott, tista' ssir biss analiżi kwalitattiva.

L-iżvantaġġi ewlenin tal-PCR tal-ewwel ġenerazzjoni:

-Suxxettibbli għal amplifikazzjoni mhux speċifika u riżultati pożittivi foloz.

-Is-sejbien jieħu żmien twil u l-operazzjoni hija ingombranti.

-Jistgħu jsiru biss testijiet kwalitattivi.

PCR kwantitattiv ta' fluworexxenza tat-tieni ġenerazzjoni

Il-PCR kwantitattiv tal-fluworexxenza (PCR Real-Time), magħrufa wkoll bħala qPCR, tintuża biex tissorvelja l-akkumulazzjoni ta 'prodotti amplifikati permezz tal-akkumulazzjoni ta' sinjali fluworexxenti billi żżid sondi fluworexxenti li jistgħu jindikaw il-progress tas-sistema ta 'reazzjoni, u biex jiġġudikaw ir-riżultati permezz tal-kurva tal-fluworexxenza, u Jista' jiġi kkwantifikat bl-għajnuna ta 'valur Cq u kurva standard.

Minħabba li t-teknoloġija qPCR titwettaq f'sistema magħluqa, il-probabbiltà ta 'kontaminazzjoni titnaqqas, u s-sinjal tal-fluworexxenza jista' jiġi mmonitorjat għal skoperta kwantitattiva, għalhekk hija l-aktar użata fil-prattika klinika u saret it-teknoloġija dominanti fil-PCR.

Is-sustanzi fluworexxenti użati fil-PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali jistgħu jinqasmu fi: Sondi fluworexxenti TaqMan, beacons molekulari u żebgħa fluworexxenti.

1) Sonda fluworexxenti TaqMan:

Waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR, tiġi miżjuda sonda fluworexxenti speċifika filwaqt li żżid par primers.Is-sonda hija oligonukleotide, u ż-żewġt itruf huma rispettivament ttikkettjati bi grupp fluworexxenti reporter u grupp fluworexxenti quencher.

Meta s-sonda tkun intatta, is-sinjal fluworexxenti emess mill-grupp reporter jiġi assorbit mill-grupp tat-tifi;waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR, l-attività tal-exonuclease 5′-3′ tal-enzima Taq tinqasam u tiddegrada s-sonda, u tagħmel il-grupp fluworexxenti reporter u quencher Il-grupp fluworexxenti huwa separat, sabiex is-sistema ta 'monitoraġġ tal-fluworexxenza tkun tista' tirċievi s-sinjal tal-fluworexxenza, jiġifieri kull darba li linja tad-DNA tiġi amplifikata, sinjal fluworexxenti ta 'formazzjoni fluworexxenti u sinkronizzata hija kompletament. il-prodott PCR.

2) Żebgħat fluworexxenti SYBR:

Fis-sistema tar-reazzjoni tal-PCR, jiġi miżjud eċċess ta 'żebgħa fluworexxenti SYBR.Wara li ż-żebgħa fluworexxenti SYBR tkun inkorporata b'mod mhux speċifiku fil-linja doppja tad-DNA, temetti sinjal fluworexxenti.Il-molekula taż-żebgħa SYBR li mhix inkorporata fil-katina ma temetti ebda sinjal fluworexxenti, u b'hekk tiżgura s-sinjal fluworexxenti Iż-żieda fil-prodotti tal-PCR hija kompletament sinkronizzata maż-żieda fil-prodotti tal-PCR.SYBR jorbot biss ma 'DNA bi strand doppju, għalhekk il-kurva tat-tidwib tista' tintuża biex tiddetermina jekk ir-reazzjoni tal-PCR hijiex speċifika.

3) Beacons molekulari

Hija sonda oligonukleotide b'tikketti doppji b'linja ta 'staminali li tifforma struttura ta' hairpin ta 'madwar 8 bażijiet fil-5 u t-3 truf.Is-sekwenzi ta 'l-aċidu nuklejku fiż-żewġt itruf huma kkomplementariment paired, li jikkawża li l-grupp fluworexxenti u l-grupp ta' tkessiħ ikunu stretti.Agħlaq, mhux se jipproduċi fluworexxenza.

Wara li jiġi ġġenerat il-prodott tal-PCR, matul il-proċess tal-ittemprar, il-parti tan-nofs tal-beacon molekulari hija mqabbda ma 'sekwenza speċifika tad-DNA, u l-ġene fluworexxenti huwa separat mill-ġene quencher biex jipproduċi fluworexxenza.

L-iżvantaġġi ewlenin tal-PCR tat-tieni ġenerazzjoni:

Is-sensittività għadha nieqsa, u l-iskoperta ta 'kampjuni ta' kopji baxxi mhix preċiża.

Hemm influwenza tal-valur fl-isfond, u r-riżultat huwa suxxettibbli għall-interferenza.

PCR diġitali tat-tielet ġenerazzjoni

PCR diġitali (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) tikkalkula n-numru tal-kopja tas-sekwenza fil-mira permezz ta 'skoperta tal-punt aħħari, u tista' twettaq skoperta kwantitattiva assoluta preċiża mingħajr ma tuża kontrolli interni u kurvi standard.

Il-PCR diġitali juża skoperta tal-endpoint u ma jiddependix fuq il-valur Ct (limitu taċ-ċiklu), għalhekk ir-reazzjoni tal-PCR diġitali hija inqas affettwata mill-effiċjenza tal-amplifikazzjoni, u t-tolleranza għall-inibituri tar-reazzjoni tal-PCR hija mtejba, bi preċiżjoni għolja u riproduċibbiltà.

Minħabba l-karatteristiċi ta 'sensittività għolja u preċiżjoni għolja, mhuwiex faċilment interferit minn inibituri tar-reazzjoni tal-PCR, u jista' jikseb kwantifikazzjoni assoluta vera mingħajr prodotti standard, li sar hotspot ta 'riċerka u applikazzjoni.

Skont il-forom differenti tal-unità ta 'reazzjoni, tista' tinqasam fi tliet tipi: sistemi mikrofluwidi, ċippa u qtar.