Fl-esperimenti qPCR, id-disinn tal-primer huwa wkoll rabta importanti ħafna.Jekk il-primers humiex adattati jew le huwa relatat mill-qrib ma 'jekk l-effiċjenza ta' amplifikazzjoni tilħaqx l-istandard, jekk il-prodotti amplifikati humiex speċifiċi, u jekk ir-riżultati sperimentali humiex disponibbli.
Allura kif tagħmel l-ispeċifiċità tal-primer qPCR aħjar?Effiċjenza għolja ta 'amplifikazzjoni?
Illum, aħna se tieħdok biex tiddisinja primers qPCR flimkien, u ħalli d-disinn tal-primer qPCR isir ħila ta 'Lore effiċjenti fl-esperimenti.
Meta tfassal qPCR primers, ġeneralment tagħti attenzjoni lill-punti li ġejjin: primers għandhom ikunu ddisinjati fuq introns kemm jista 'jkun, it-tul tal-prodott għandu jkun 100-300 bp, il-valur Tm għandu jkun qrib kemm jista' jkun għal 60 ° C, u l-primers upstream u downstream għandhom ikunu qrib kemm jista 'jkun, u t-tmiem tal-primer għandu jkun G jew C, eċċ. stenna.
1. Disinn ta' primers li jkopru l-introni
Meta tfassal primers qPCR, l-għażla ta 'primers iddisinjati madwar introni tista' tevita li l-mudell gDNA jiġi amplifikat, u l-prodotti huma kollha derivati ​​mill-amplifikazzjoni ta 'cDNA, u b'hekk telimina l-influwenza tal-kontaminazzjoni tal-gDNA.
2. Tul tal-primer
It-tul tal-primer huwa ġeneralment bejn 18-30 nt, u t-tul tal-prodott ta 'amplifikazzjoni għandu jkun ikkontrollat ​​bejn 100-300 bp kemm jista' jkun.
Jekk il-primer ikun qasir wisq, iwassal għal amplifikazzjoni mhux speċifika, u jekk ikun twil wisq, faċilment jifforma struttura sekondarja (bħal struttura ta 'hairpin).Jekk il-prodott ta 'amplifikazzjoni huwa twil wisq, mhuwiex adattat għar-reazzjoni tal-polimerażi, li se taffettwa l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR.
3. Kontenut GC u valur Tm
Il-kontenut tal-GC tal-primers għandu jiġi kkontrollat ​​bejn 40% u 60%.Jekk ikun għoli wisq jew baxx wisq, ma jwassalx biex tinbeda r-reazzjoni.Il-kontenut tal-GC tal-primers 'il quddiem u lura għandu jkun qrib l-istess sabiex jinkiseb l-istess valur Tm u temperatura ta' ttemprar.
Il-valur Tm għandu jkun bejn 55-65 ° C kemm jista 'jkun, ġeneralment madwar 60 ° C, u l-valur Tm tal-upstream u downstream għandu jkun qrib kemm jista' jkun, preferibbilment mhux aktar minn 4 ° C.
4. Evita li tagħżel A fit-tarf 3′ tal-primer
Meta t-tarf 3′ tal-primer ma jkunx imqabbel, hemm differenzi kbar fl-effiċjenza tas-sintesi ta 'bażijiet differenti.Meta l-aħħar bażi hija A, tista 'wkoll tibda s-sintesi tal-katina anke fil-każ ta' nuqqas ta 'tqabbil, u meta l-aħħar bażi tkun T Meta , l-effiċjenza ta' induzzjoni ta 'nuqqas ta' tqabbil titnaqqas ħafna.Għalhekk, ipprova tevita li tagħżel A fit-tarf 3 'tal-primer, u huwa aħjar li tagħżel T.
Jekk huwa primer ta 'sonda, it-tarf 5' tas-sonda ma jistax ikun G, għax anke meta bażi G waħda tkun imqabbda mal-grupp ta' reporter fluworexxenti FAM, G jista 'wkoll jaqta' s-sinjal fluworexxenti emess mill-grupp FAM, li jirriżulta f'riżultati negattivi foloz.Jidher.
5. Distribuzzjoni bażi
Id-distribuzzjoni tal-erba 'bażijiet fil-primer hija preferibbilment każwali, tevita aktar minn 3 G jew C konsekuttivi fit-tarf 3', u aktar minn 3 konsekuttiviG jew C huma faċli biex jiġġeneraw pairing fir-reġjun tas-sekwenza b'ħafna GC.
6. Ir-reġjun tad-disinn tal-primer għandu jevita strutturi sekondarji kumplessi.
L-istruttura sekondarja ffurmata mill-linja waħda tal-prodott ta 'amplifikazzjoni se taffettwa l-progress bla xkiel tal-PCR.Billi tbassar jekk hemmx struttura sekondarja fis-sekwenza fil-mira bil-quddiem, ipprova tevita dan ir-reġjun fid-disinn ta 'primers.
7. Il-primers infushom u bejn il-primers għandhom jippruvaw jevitaw bażijiet komplementari konsekuttivi.
Ma jistax ikun hemm komplementarjetà konsekuttiva ta '4 bażi bejn il-primer innifsu u l-primer.Il-primer innifsu m'għandux ikollu sekwenza komplementari, inkella se jintewa lilu nnifsu biex jifforma struttura ta 'hairpin, li se taffettwa l-kombinazzjoni ta' ttemprar tal-primer u l-mudell.
Sekwenzi komplementari ma jistgħux jeżistu bejn primers upstream u downstream.Il-komplimentarjetà bejn il-primers se tipproduċi dimeri tal-primer, li se tnaqqas l-effiċjenza tal-PCR u saħansitra taffettwa l-eżattezza kwantitattiva.Jekk l-istrutturi primer-dimer u hairpin huma inevitabbli, il-valur △G m'għandux ikun għoli wisq (għandu jkun inqas minn 4.5 kcal/mol).
8. Il-primers jamplifikaw il-prodott speċifiku fil-mira.
L-għan aħħari tal-kxif tal-qPCR huwa li tifhem l-abbundanza tal-ġene fil-mira.Jekk isseħħ amplifikazzjoni mhux speċifika, il-kwantifikazzjoni ma tkunx preċiża.Għalhekk, wara li l-primers jiġu ddisinjati, jeħtieġ li jiġu ttestjati minn BLAST, u l-ispeċifiċità tal-prodotti titqabbel fid-database tas-sekwenza.
Sussegwentement, nieħdu l-ġene uman GAS6 (Growth arrest specific 6) bħala eżempju biex tiddisinja primers qPCR.
01 ġene tal-mistoqsija
Homo GAS6permezz ta' NCBI.Hawnhekk, għandna nagħtu attenzjoni biex inqabblu l-isem tal-ġene u l-ispeċi biex niżguraw li huma konsistenti.
02 Sib is-sekwenza tal-ġeni
(1) Jekk is-sekwenza fil-mira hija DNA ġenomika, agħżel l-ewwel waħda, li hija s-sekwenza tad-DNA ġenomika tal-ġene.
(2) Jekk is-sekwenza fil-mira hija mRNA, agħżel it-tieni waħda.Wara li ddaħħal, ikklikkja "CDS" fit-tabella hawn taħt.Is-sekwenza ta' l-isfond kannella hija s-sekwenza ta' kodifikazzjoni tal-ġene.
03 Primers tad-disinn
Daħħal l-interface Primer-BLAST
Daħħal in-numru tas-sekwenza tal-ġeni jew is-sekwenza fil-format Fasta fuq ix-xellug ta' fuq, u imla l-parametri rilevanti.

Ikklikkja "Ikseb primers" u NCBI se jitfaċċa biex jgħidlek li tali għażla ta 'parametri se tiġi amplifikata għal varjanti oħra ta' splicing.Nistgħu niċċekkjaw il-varjanti ta 'splicing differenti u nissottomettuhom biex tikseb il-par primer xieraq (kif muri fil-figura hawn taħt).Dan il-proċess jista' jieħu għexieren ta' sekondi biex jaħdem.
It-temperaturi ta 'ttemprar ta' dawn il-pari primer huma kollha madwar 60 ° C.Skont l-iskop tal-esperiment, agħżel primers b'tul moderat, speċifiċità tajba u inqas awto-kumplimentazzjoni tal-primers għall-esperiment, u r-rata ta 'suċċess hija pjuttost għolja!
04Verifika tal-ispeċifiċità tal-primer
Fil-fatt, minbarra li jfassal primers, Primer-Blast jista 'wkoll jevalwa l-primers li ddisinajna aħna stess.Irritorna għall-paġna tad-disinn tal-primer, daħħal il-primers upstream u downstream li ddisinjajna, u parametri oħra mhux se jiġu aġġustati.Wara li tissottometti, tista 'tara jekk il-par ta' primers jeżistux ukoll fuq ġeni oħra.Jekk kollha kemm huma jintwerew fuq il-ġene irridu namplifikaw , li jindika li l-ispeċifiċità ta 'dan il-par ta' primers hija kbira!(Per eżempju, dan huwa l-uniku riżultat tal-mistoqsija primer!)

05 Ġudizzju tal-kwalità tal-Primer
X'tip ta 'primer huwa l-primer "perfett" li jgħaqqad "effiċjenza ta' amplifikazzjoni sa standard", "karatteristiċi tal-prodott amplifikati", u "riżultati sperimentali affidabbli"?
Effiċjenza ta 'amplifikazzjoni

kurva tat-tidwib
L-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-primers tilħaq 90% -110%, li jfisser li l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni hija tajba, u l-kurva tat-tidwib għandha quċċata waħda u ġeneralment Tm> 80 ° C, li jfisser li l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni hija tajba.
 
Prodotti Relatati:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman