• facebook
  • linkedin
  • youtube

 Il-PCR kwantitattiv ta 'fluworexxenza (magħruf ukoll bħala TaqMan PCR, minn hawn 'il quddiem imsejjaħ FQ-PCR) hija teknoloġija kwantitattiva ta' aċidu nuklejku ġdida żviluppata minn PE (Perkin Elmer) fl-Istati Uniti fl-1995. Din it-teknoloġija hija bbażata fuq PCR konvenzjonali billi żżid sondi ttikkettjati fluworexxenti.Meta mqabbel ma 'PCR flessibbli, FQ-PCR għandu ħafna vantaġġi biex jirrealizza l-funzjoni kwantitattiva tiegħu.Dan l-artikolu għandu l-intenzjoni li jiddeskrivi fil-qosor il-karatteristiċi, il-prinċipji, il-metodi u l-applikazzjonijiet tat-teknoloġija.

1 Karatteristiċi

FQ-PCR mhux biss għandu s-sensittività għolja tal-PCR ordinarju, iżda wkoll minħabba l-applikazzjoni ta 'sondi fluworexxenti, jista' jiskopri direttament il-bidla tas-sinjal fluworexxenti waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR permezz tas-sistema ta 'konduzzjoni fotoelettrika biex tikseb riżultati kwantitattivi, li jegħleb ħafna nuqqasijiet ta' PCR konvenzjonali, għalhekk għandu wkoll l-ispeċifiċità għolja tal-ibridizzazzjoni tad-DNA u t-teknoloġija ta 'spettroskopija għolja.

Pereżempju, il-prodotti ġenerali tal-PCR jeħtieġ li jiġu osservati b'elettroforesi tal-ġel tal-agarose u tbajja tal-bromur tal-etidju b'dawl ultravjola jew permezz tal-elettroforeżi tal-ġel tal-polyacrylamide u tbajja tal-fidda.Dan mhux biss jeħtieġ strumenti multipli, iżda jieħu wkoll ħin u sforz.It-tbajja użata Ethidium bromide hija ta 'ħsara għall-ġisem tal-bniedem, u dawn il-proċeduri sperimentali kkumplikati jipprovdu opportunitajiet għal tniġġis u pożittivi foloz.Madankollu, FQ-PCR jeħtieġ biss li tiftaħ l-għatu darba waqt it-tagħbija tal-kampjun, u l-proċess sussegwenti huwa operazzjoni ta 'tubu kompletament magħluq, li ma teħtieġx ipproċessar ta' wara PCR, tevita ħafna żvantaġġi f'operazzjonijiet PCR konvenzjonali.L-esperiment ġeneralment juża ċ-ċiklatur termali ABI7100 PCR żviluppat mill-kumpanija PE.

L-istrument għandu l-karatteristiċi li ġejjin: ① Applikazzjoni wiesgħa: Jista 'jintuża għall-kwantifikazzjoni tal-prodott tad-DNA u RNA PCR, riċerka dwar l-espressjoni tal-ġeni, skoperta ta' patoġeni, u ottimizzazzjoni tal-kundizzjonijiet tal-PCR.② Prinċipju kwantitattiv uniku: Bl-użu ta 'sondi ttikkettjati b'mod fluworexxenti, l-ammont ta' fluworexxenza se jakkumula maċ-ċiklu tal-PCR wara l-eċitazzjoni tal-lejżer, sabiex jinkiseb l-iskop ta 'kwantifikazzjoni.③ Effiċjenza għolja tax-xogħol: Ċiklatur termali 9600 PCR inkorporat, ikkontrollat ​​mill-kompjuter minn siegħa sa sagħtejn biex jitlesta l-amplifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni ta '96 kampjun awtomatikament u sinkronikament.④ Ebda ħtieġa għall-elettroforeżi tal-ġel: M'hemmx bżonn li l-kampjun jiġi dilwit u elettroforeżi, uża biss sonda speċjali biex tiskopri direttament fit-tubu tar-reazzjoni.⑤L-ebda tniġġis fil-pipeline: It-tubu ta 'reazzjoni magħluq għal kollox u s-sistema ta' konduzzjoni fotoelettrika huma adottati, għalhekk m'hemmx għalfejn tinkwieta dwar it-tniġġis.⑥Ir-riżultati huma riproduċibbli: il-firxa dinamika kwantitattiva hija sa ħames ordnijiet ta 'kobor.Għalhekk, peress li din it-teknoloġija ġiet żviluppata b'suċċess, ġiet apprezzata minn ħafna riċerkaturi xjentifiċi u ġiet applikata f'ħafna oqsma.

2 Prinċipji u metodi

Il-prinċipju ta 'ħidma ta' FQ-PCR huwa li tuża l-attività 5′→3′ exonuclease tal-enzima Taq biex iżżid sonda ttikkettjata b'mod fluworexxenti mas-sistema ta 'reazzjoni tal-PCR.Is-sonda tista' speċifikament ibridizza mal-mudell tad-DNA li jinsab fis-sekwenza primer.It-tarf 5 tas-sonda huwa ttikkettjat bil-ġene tal-emissjoni tal-fluworexxenza FAM (6-carboxyfluorescein, quċċata tal-emissjoni tal-fluworexxenza f'518nm), u t-3′tarf huwa ttikkettjat b'Il-grupp ta' tkessiħ tal-fluworexxenza TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, sonda tal-emissjoni tal-fluworexxenza ta' 832'beak għall-fosfat tal-fluworexxenza). jipprevjeni li s-sonda tiġi estiża waqt l-amplifikazzjoni tal-PCR.Meta s-sonda tibqa' intatta, il-grupp quencher jrażżan l-emissjoni tal-fluworexxenza tal-grupp li jarmi.Ladarba l-grupp li jarmi jiġi separat mill-grupp tat-tifi, l-inibizzjoni titneħħa, u d-densità ottika f'518nm tiżdied u tiġi skoperta mis-sistema ta 'detezzjoni tal-fluworexxenza. Fil-fażi ta' rinaturazzjoni, is-sonda ibridizza mad-DNA tal-mudell, u l-enzima Taq fil-fażi ta 'estensjoni timxi tul il-mudell tad-DNA bl-estensjoni tal-primer.Meta s-sonda tinqata ', l-effett tat-tifi jiġi rilaxxat u s-sinjal fluworexxenti jiġi rilaxxat.Kull darba li l-mudell jiġi kkupjat, tinqata 'sonda, akkumpanjata mir-rilaxx ta' sinjal fluworexxenti.Peress li hemm relazzjoni waħda għal waħda bejn in-numru ta 'fluworofori rilaxxati u n-numru ta' prodotti PCR, din it-teknika tista 'tintuża biex tikkwantifika b'mod preċiż il-mudell.L-istrument sperimentali ġeneralment juża ċ-ċiklatur termali ABI7100 PCR żviluppat mill-kumpanija PE, u jistgħu jintużaw ukoll ċiklaturi termali oħra.Jekk is-sistema ta 'reazzjoni tat-tip ta' reazzjoni ABI7700 tintuża għall-esperiment, wara li titlesta r-reazzjoni, ir-riżultati kwantitattivi jistgħu jingħataw direttament permezz ta 'analiżi tal-kompjuter.Jekk tuża ċiklaturi termali oħra, għandek bżonn tuża ditekter tal-fluworexxenza biex tkejjel is-sinjal tal-fluworexxenza fit-tubu tar-reazzjoni fl-istess ħin biex tikkalkula RQ+, RQ-, △RQ.RQ + jirrappreżenta l-proporzjon tal-intensità tal-luminexxenza tal-grupp ta 'emissjoni fluworexxenti tat-tubu tal-kampjun għall-intensità tal-luminexxenza tal-grupp ta' quenching, RQ- jirrappreżenta l-proporzjon tat-tnejn fit-tubu vojt, △RQ (△RQ=RQ + -RQ-) jirrappreżenta l-ammont ta 'bidla tas-sinjal fluworexxenti matul PCR Wara l-ipproċessar tad-dejta jistgħu jinkisbu, kwantitattivi.Minħabba l-introduzzjoni ta 'sondi fluworexxenti, l-ispeċifiċità tal-esperiment titjieb b'mod sinifikanti.Id-disinn tas-sonda ġeneralment għandu jissodisfa l-kundizzjonijiet li ġejjin: ①It-tul tas-sonda għandu jkun madwar 20-40 bażi biex jiżgura l-ispeċifiċità tal-irbit.②Il-kontenut tal-bażijiet GC huwa bejn 40% u 60% biex tiġi evitata d-duplikazzjoni ta 'sekwenzi nukleotidi singoli.③ Evita l-ibridizzazzjoni jew il-koinċidenza ma 'primers.④ L-istabbiltà tal-irbit bejn is-sonda u l-mudell hija akbar mill-istabbiltà tal-irbit bejn il-primer u l-mudell, għalhekk il-valur Tm tas-sonda għandu jkun mill-inqas 5 ° C ogħla mill-valur Tm tal-primer.Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni tas-sonda, l-omoloġija bejn is-sonda u s-sekwenza tal-mudell, u d-distanza bejn is-sonda u l-primer kollha għandhom impatt fuq ir-riżultati sperimentali.

Prodotti relatati:

Ċina Lnc-RT Heroᵀᴹ I (B'gDNase) (Super Premix għal sinteżi ta' cDNA tal-ewwel linja minn lncRNA) Manifattur u Fornitur |Foregene (foreivd.com)

Ċina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Manifattur u Fornitur |Foregene (foreivd.com)


Ħin tal-post: Ottubru-15-2021