• facebook
  • linkedin
  • youtube

Il-PCR diretta hija reazzjoni li tuża direttament tessuti tal-annimali jew tal-pjanti għall-amplifikazzjoni mingħajr estrazzjoni tal-aċidu nuklejku.F'ħafna modi, il-PCR dirett jaħdem bħal PCR regolari

Id-differenza ewlenija hija l-buffer tad-dwana użat fil-PCR dirett, il-kampjun jista 'jiġi soġġett direttament għar-reazzjoni tal-PCR mingħajr estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, iżda hemm rekwiżiti korrispondenti għat-tolleranza tal-enzimi u l-kompatibilità tal-buffer involut fir-reazzjoni diretta tal-PCR.

Għalkemm hemm aktar jew inqas inibituri tal-PCR f'kampjuni komuni, il-PCR dirett xorta jista 'jikseb amplifikazzjoni affidabbli taħt l-azzjoni ta' enżimi u buffers.Ir-reazzjoni tal-PCR tradizzjonali teħtieġ aċidu nuklejku ta 'kwalità għolja bħala mudell, li jista' jinibixxi l-progress bla xkiel tar-reazzjoni tal-PCR jekk il-mudell ikun fih proteini u impuritajiet oħra.Direct PCR bħalissa hija waħda mit-teknoloġiji l-aktar popolari fil-qasam tad-dijanjostika molekulari.

01 Direct PCR kien oriġinarjament użat għall-annimali u l-pjanti

L-aktar applikazzjoni bikrija ta 'PCR dirett hija fil-qasam ta' annimali u pjanti, bħad-demm, tessut u xagħar tal-far, qattus, tiġieġ, fenek, nagħaġ, baqar, eċċ., weraq tal-pjanti u żrieragħ, eċċ., użati biex jistudjaw ġenotipi, transġeniċi, skoperta ta 'plasmid, analiżi ta' knockout tal-ġeni, identifikazzjoni tas-sors tad-DNA, analiżi ta 'speċi u identifikazzjoni oqsma oħra, SNP.

Dawn l-oqsma għandhom xi karatteristiċi komuni, jiġifieri, il-kontenut tal-ġene fil-mira huwa relattivament għoli u l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku hija idejqek, għalhekk il-PCR dirett jista 'mhux biss jiffranka l-ħin u jkollu impatt żgħir fuq ir-riżultati, iżda wkoll jiffranka l-ispiża.

Il-PCR dirett użat għall-iskoperta tal-patoġeni huwa kwistjoni ta 'snin riċenti, xi manifatturi tar-reaġenti tal-PCR għamlu ħafna sforzi f'din id-direzzjoni meta jagħmlu l-innovazzjoni.Speċjalment f'din l-epidemija COVID-19, ħafna prodotti ta 'skoperta bħal dawn dehru fis-suq, bħal SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) riċerkati u żviluppati minn Foregene, li juża teknoloġija RT PCR f'ħin reali (rRT-PCR) għal skoperta kwalitattiva ta' kampjuni tan-nifs tan-nixxiefa jew kampjun tan-nifs tal-bniedem. s.

Foregene hija waħda mill-kumpaniji li jużaw teknoloġija Direct PCR, għall-iskoperta ta 'ORF1ab normali, N, E, uvarjant nisel aċidi nuklejċi f'kampjuni ta' swab nażofarinġi jew orofarinġali tal-bniedem bħal SARS-CoV-2 nisel B.1.1.7 (UK), nisel B.1.351 (ZA), nisel B.1.617 (IND) u nisel P.1 (BR).

02  Reaġenti meħtieġa għal PCR dirett

Kampjun Lysate

Il-lisat tal-kampjun jista 'jiġi kkonfigurat minnek innifsek jew mixtri.Id-differenza fil-kompożizzjoni ta 'marki differenti ta' lysate se tagħmel il-kapaċità ta 'lysing differenti, u allura l-ħin tal-lysing se jkun kemmxejn differenti.Per eżempju, għall-preparazzjoni ta 'kampjuni tat-tessuti ta' l-annimali, 30 minuta jew liżi matul il-lejl hija ġeneralment rakkomandata, u s-soluzzjoni ta 'liżi għall-viruses tvarja minn 3-10 minuti.

Taħlita prinċipali tal-PCR

Huwa rakkomandat li tuża DNA polymerase hot-start biex ittejjeb l-amplifikazzjoni speċifika u żżid il-kapaċità ta 'amplifikazzjoni.Il-qalba tal-PCR dirett hija polimerażi tolleranti ħafna.

Elimina jew inibixxi komponenti fil-kampjun li jaffettwaw l-amplifikazzjoni tad-DNA

Wara li l-kampjun jiġi pproċessat bil-lisat, il-proteini, il-lipidi u debris taċ-ċelluli oħra jiġu rilaxxati, dawn is-sustanzi jinibixxu r-reazzjoni tal-PCR.Għalhekk, il-PCR dirett jeħtieġ iż-żieda ta 'tneħħija korrispondenti jew inibituri biex titnaqqas l-influwenza ta' dawn il-fatturi.

03  Ġabra ta 'ħames punti ta' għarfien ta 'PCR dirett

L-ewwel, it-teknoloġija PCR diretta hija teknoloġija PCR diretta għal diversi kampjuni bijoloġiċi.Taħt din il-kundizzjoni teknika, m'hemmx bżonn li tissepara u estratta l-aċidu nuklejku, tuża direttament il-kampjun tat-tessut bħala l-oġġett, u żid il-primers tal-ġeni fil-mira huma biex iwettqu r-reazzjoni tal-PCR.

It-tieni, it-teknoloġija PCR diretta mhix biss teknoloġija tradizzjonali ta 'amplifikazzjoni tal-mudell tad-DNA, iżda tinkludi wkoll PCR ta' traskrizzjoni inversa tal-mudell RNA.

It-tielet, it-teknoloġija PCR diretta mhux biss twettaq direttament reazzjonijiet PCR kwalitattivi ta 'rutina fuq kampjuni tat-tessuti, iżda tinkludi wkoll reazzjonijiet qPCR Real-Time, li teħtieġ li s-sistema ta' reazzjoni jkollha kapaċità qawwija ta 'interferenza tal-fluworexxenza kontra l-isfond u quenchers endoġeni tal-fluworexxenza l-abbiltà antagonistiku.

Ir-raba ', il-kampjuni mmirati mit-teknoloġija Direct PCR jeħtieġu biss ir-rilaxx ta' mudelli ta 'aċidu nuklejku, u ma jneħħux proteini, polisakkaridi, jonji tal-melħ, eċċ li jinterferixxu mar-reazzjoni tal-PCR.Li jeħtieġ li l-polimerażi ta 'l-aċidu nuklejku u l-PCR Mix fis-sistema ta' reazzjoni jkollhom reżistenza u adattabilità eċċellenti biex jiżguraw l-attività ta 'l-enzima u l-eżattezza tar-replikazzjoni taħt kondizzjonijiet kumplessi.

Il-ħames, il-kampjun tat-tessut immirat mit-teknoloġija Direct PCR mingħajr ebda trattament ta 'arrikkiment ta' aċidu nuklejku u l-ammont ta 'mudell huwa żgħir ħafna, li jeħtieġ li s-sistema ta' reazzjoni jkollha sensittività estremament għolja u effiċjenza ta 'amplifikazzjoni.


Ħin tal-post: Ġunju-28-2021