Nemmen li kulħadd dejjem se jiltaqa' ma' problemi bħal dawn meta jagħmlu reazzjonijiet tal-PCR, iżda ħafna minnhom jistgħu jiġu kklassifikati f'żewġ problemi ewlenin:

Ftit wisq amplifikazzjoni tal-mudell tal-ġene (amplifikazzjoni);
Wisq amplifikazzjoni tal-ġeni mhux fil-mira.
L-użu ta 'addittivi hija waħda mill-istrateġiji komuni biex issolvi dawn il-problemi.Normalment ir-rwol tal-addittivi għandu żewġ aspetti:
struttura sekondarjatal-ġeni (struttura sekondarja);
Naqqas priming mhux speċifiku.
Illum, l-editur ser jintroduċilek fil-qosor l-addittivi komuni fir-reazzjonijiet tal-PCR u l-funzjonijiet tagħhom.
Addittivi li jnaqqsu l-istruttura sekondarja
sulfossidu(DMSO)
kampjuni tal-ġenib'kontenut għoli ta' GC.Madankollu, DMSO wkoll inaqqas ħafna l-attività tal-polimerażi Taq.Għalhekk, kulħadd irid jibbilanċja l-aċċessibilità tal-mudell u l-attività tal-polimerażi.L-editur jissuġġerixxi li tista 'tipprova konċentrazzjonijiet differenti ta' DSMO, bħal minn 2% sa 10%, biex issib il-konċentrazzjoni li taqbel mal-esperiment tiegħek.
Deterġenti mhux joniċi
Deterġenti mhux joniċi, bħal 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 jew NP-40, ġeneralment inaqqsu l-istruttura sekondarja tad-DNA.Għalkemm dan jista 'jżid l-amplifikazzjoni tal-ġene template, se jikkawża wkoll l-inkwiet ta' amplifikazzjoni mhux speċifika.Allura, dawn l-addittivi jaħdmu tajjeb għal reazzjonijiet PCR b'rendiment baxx mingħajr debris, iżda mhux daqshekk tajjeb għal reazzjonijiet PRC relattivament impuri.Benefiċċju ieħor ta 'deterġenti mhux joniċi huwa t-tnaqqis tal-kontaminazzjoni SDS.Normalment matul il-proċess ta 'estrazzjoni tad-DNA, SDS se jinġieb għall-pass PCR, li jinibixxi ħafna l-attività tal-polimerażi.Għalhekk, iż-żieda ta '0.5% Tween-20 jew Tween-40 mar-reazzjoni tista' tinnewtralizza l-effetti negattivi ta 'SDS.
Betaine_
Betaine jista 'jtejjeb l-amplifikazzjoni tad-DNA billi jnaqqas il-formazzjoni ta' struttura sekondarja u ġeneralment huwa żieda "misterjuża" għal kits PCR kummerċjali.Jekk trid tuża betaine, għandek tpoġġi betaine jew betaine mono-hydrate (Betaine jew Betaine mono-hydrate), iżda mhux betaine hydrochloride (Betaine HCl), aġġusta għal konċentrazzjoni finali ta '1-1.7M.Betaine jista 'wkoll jgħin biex itejjeb l-ispeċifiċità minħabba li jelimina d-dipendenza tal-kompożizzjoni tal-par bażi tad-tidwib tad-DNA/denaturazzjoni tad-DNA.
Addittivi biex inaqqsu l-priming mhux speċifiku
Formamide
Formamide huwa addittiv PCR organiku użat komunement.Jista 'jgħaqqad ma' skanalatura maġġuri u skanalatura minuri fid-DNA, u b'hekk tnaqqas l-istabbiltà tal-helix doppja tad-DNA kaptan u tnaqqas it-temperatura tat-tidwib tad-DNA.Il-konċentrazzjoni ta 'formamide użata fl-esperimenti PCR hija ġeneralment 1% -5%.
Tetrametilklorur tal-ammonju( TMAC)
Il-klorur tat-tetrametilammonju jista 'jżid l-ispeċifiċità tal-ibridizzazzjoni (l-ispeċifiċità tal-ibridizzazzjoni) u jżid it-temperatura tat-tidwib tad-DNA.Għalhekk, TMAC jista 'jneħħi priming mhux speċifiku u jnaqqas it-twaħħil ħażin ta' DNA u RNA.Jekk tużaprimers deġeneratifir-reazzjoni tal-PCR, ftakar li żżid TMAC, li huwa komunement użat f'konċentrazzjoni ta '15-100mM.
Addittivi Komuni Oħra
Minbarra ż-żewġ kategoriji ta 'addittivi msemmija hawn fuq, hemm ħafna addittivi komuni fir-reazzjonijiet tal-PCR, għalkemm għandhom funzjonijiet differenti, huma wkoll importanti ħafna.
Jone tal-manjeżju
Il-jone tal-manjeżju huwa kofattur indispensabbli (kofattur) tal-polimerażi, jiġifieri, mingħajr jone tal-manjeżju, il-polimerażi hija inattiva.Madankollu, wisq joni tal-manjeżju jistgħu jaffettwaw ukoll l-effiċjenza tal-polimerażi.Il-konċentrazzjoni tal-joni tal-manjeżju f'kull reazzjoni tal-PCR se tvarja.Aġenti kelanti (bħal EDTA jew ċitrat), il-konċentrazzjoni ta 'dNTPs u proteini kollha jaffettwaw il-konċentrazzjoni ta' joni tal-manjeżju.Għalhekk, jekk għandek problemi bl-esperiment PCR tiegħek, tista 'tipprova tibdel konċentrazzjonijiet differenti tal-jone tal-manjeżju, pereżempju, minn 1.0 sa 4.0mM, b'intervall ta' 0.5-1mM bejniethom.
Ta 'min jinnota li ċikli multipli ta' ffriżar u tidwib jistgħu jwasslu għal stratifikazzjoni tal-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-klorur tal-manjeżju.Għalhekk, trid dewweb kompletament qabel kull użu, u ħallat sew qabel tużaha.
Albumina tas-serum bovin(Albumina bovina, BSA)
Fl-esperimenti tal-kimika molekulari, l-albumina tas-serum bovin hija addittiv komuni ħafna, speċjalment fid-diġestjoni ta 'enżimi ta' restrizzjoni u esperimenti PCR.Fir-reazzjonijiet tal-PCR, il-BSA huwa ta 'għajnuna fit-tnaqqis ta' kontaminanti bħal komposti fenoliċi.U jingħad ukoll li jista 'jnaqqas l-adeżjoni tar-reaġenti mal-ħajt tat-tubu tat-test.Fir-reazzjoni tal-PCR, ġeneralment il-konċentrazzjoni ta 'BSA miżjuda tista' tilħaq 0.8 mg/ml.
 
Prodotti Relatati:
Eroj PCR(biż-żebgħa)
Eroj PCR