Il-verifika tal-prestazzjoni ta 'primers u sondi fl-istadju bikri tar-reaġenti PCR u d-determinazzjoni tal-kundizzjonijiet ta' reazzjoni l-aktar xierqa huma l-prerekwiżiti biex jiġi żgurat il-progress bla xkiel ta 'esperimenti formali.
Allura kif għandna bżonn nikkonfermaw is-sonda tal-primer fl-istadju bikri?
L-indikaturi ewlenin huma linja bażi, kurva ta 'amplifikazzjoni, valur ct, effiċjenza ta' amplifikazzjoni, sejbien ta 'kampjuni ta' konċentrazzjoni baxxa, CV, eċċ.
Linja bażi
Il-linja bażi hija l-linja orizzontali fil-kurva tal-amplifikazzjoni tal-PCR.Fl-ewwel ftit ċikli tar-reazzjoni tal-amplifikazzjoni tal-PCR, is-sinjal tal-fluworexxenza ma jinbidilx ħafna u jifforma linja dritta.Din il-linja dritta hija l-linja bażi.
Meta tgħarbel is-sondi tal-primer tal-PCR, agħti attenzjoni għal jekk il-linja bażi hijiex livell.Il-purità tal-konċentrazzjoni tas-sonda tal-primer se taffettwa l-linja bażi, bħal li tikkawża li l-linja bażi titla 'jew tonqos.Il-linja bażi hija wkoll indikatur intuwittiv ħafna.
Kurva ta' amplifikazzjoni
Indikatur intuwittiv ieħor huwa l-forma tal-kurva ta 'amplifikazzjoni.L-aħjar huwa li jkollok kurva f'forma ta 'S biex tevita amplifikazzjoni sekondarja jew kurvi oħra ta' amplifikazzjoni anormali.
Valur Ct
In-numru ta 'ċikli li jikkorrispondu għall-punt ta' inflessjoni mil-linja bażi għat-tkabbir esponenzjali huwa l-valur Ct.
Għall-istess kampjun, sondi ta 'primer differenti jirriżultaw f'kurvi ta' amplifikazzjoni differenti, u l-valur Ct korrispondenti se jkun affettwat mill-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni u l-grad ta' interferenza.Fit-teorija, l-iżgħar il-valur Ct tas-sonda primer nagħżlu, l-aħjar.
Effiċjenza tal-Amplifikazzjoni
Wieħed mill-aktar metodi affidabbli u stabbli għall-evalwazzjoni tal-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR huwa l-kurva standard, li hija wkoll rikonoxxuta b'mod wiesa 'minn riċerkaturi.Il-metodu jinvolvi li tagħmel serje ta 'kampjuni biex tikkontrolla n-numru relattiv ta' mudelli ta 'mira.Dawn il-kampjuni huma ġeneralment magħmula minn dilwizzjonijiet serjali ta 'soluzzjonijiet ta' stokk ikkonċentrat, l-aktar użat komunement huwa dilwizzjoni ta '10 darbiet.Bl-użu ta 'serje ta' kampjuni dilwiti, bl-użu ta 'programm qPCR standard biex jamplifika biex jikseb il-valur Cq, u finalment iġbed kurva standard skond il-konċentrazzjoni ta' kull kampjun u l-valur Cq korrispondenti biex tikseb l-ekwazzjoni lineari Cq= -klgX0 + b, u l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni E=10(-1 /k)-1.Meta tuża qPCR għal analiżi kwantitattiva, l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni hija meħtieġa li tkun fil-medda ta' 90% -110% (3.6> k> 3.1).
Sejbien ta' Kampjuni b'konċentrazzjoni baxxa
Meta l-konċentrazzjoni tal-kampjun tkun baxxa, ir-rati ta 'skoperta ta' sondi ta 'primer differenti huma differenti.Aħna nagħżlu 20 kampjun ta 'konċentrazzjoni baxxa biex nirreplikaw, u s-sistema primer-probe bl-ogħla rata ta' skoperta hija l-aħjar.
Koeffiċjent ta' Varjazzjoni (CV)
Jistgħu jiġu skoperti 10 kampjuni duplikati b'sondi ta 'primer differenti skont l-istandard tal-linja tar-reaġent għall-iskoperta tal-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku.
Reaġenti kwantitattivi:
Eżattezza
L-eżattezza fi ħdan lott wieħed għandha tilħaq: il-koeffiċjent tal-varjazzjoni (CV,%) tal-valur logaritmiku tal-konċentrazzjoni tat-test huwa ≤5%.Meta l-konċentrazzjoni tal-kampjun tkun baxxa, il-koeffiċjent tal-varjazzjoni (CV,%) tal-logaritmu tal-konċentrazzjoni ta 'skoperta huwa ≤10%
Reaġenti kwalitattivi:
Eżattezza
L-eżattezza fi ħdan lott wieħed għandha tilħaq:
(1) Koeffiċjent tal-varjazzjoni tal-valur Ct (CV,%) ≤5%
L-istess kampjun jiġi ttestjat b'mod parallel għal 10 darbiet, u r-riżultati tat-test għandhom ikunu konsistenti
Ħin tal-post: 18-Settembru 2021
